桑白盾蚧Pseudaulacaspis pentagona(Targioni-Tozzetti)是世界性的花木和经济林木的害虫。该虫在我国北方一年发生3代,以受精雌成虫过冬,4月下旬将卵产于介壳下,5月中、下旬1龄若虫爬出介壳,在树枝干上活动扩散,选择合适位置固定,口针刺入树皮内吸食汁液,虫体开始分泌蜡绒,逐渐形成介壳。蜡壳具有保护功能,使化学药物不易渗透,防治十分困难。本研究对山西省太原市绿化树木白蜡树上的桑白盾蚧进行观察研究,分离获得了病原真菌,并进行了一系列的病理学研究,为生物防治提供依据。研究内容:1、桑白盾蚧各龄期发育及显微形态特征的观察,并制作各龄期永久玻片标本;2、桑白盾蚧自然感染死亡的特征观察、虫尸收集、病原真菌的分离、纯化、回接杀虫实验、病原菌株TYL001的显微和超微形态特征的观察及物种鉴定、菌株的基因序列(ITS、线粒体小rRNA亚基(rns)、线粒体NADH脱氢酶亚基3(nad3))测定、系统发育树的构建及菌种的分子鉴定;3、TYL001菌株5种不同浓度的孢子悬浮液(1.0×10~6孢子/mL、5.0×10~6孢子/mL、1.O×10~7孢子/mL、5.0×10~7孢子/mL、1.0×10~8孢子/mL)侵染桑白盾蚧雌成虫,研究桑盾蚧的感染率和感染中时;利用光学显微、扫描电镜和透射电镜技术观察病原真菌对桑白盾蚧的侵染过程与病理学特征;以桑白盾蚧雌成虫体壁作为菌株的唯一碳源制作液体培养基,研究真菌降解体壁时3种胞外酶(脂肪酶、类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶)的酶活性变化。研究结果:1、桑白盾蚧雌成虫介壳与树体接触紧密,介壳呈圆形或椭圆形,灰白色,有明显的螺旋纹,背面隆起;桑白盾蚧雌成虫的虫体宽梨形或短卵形,颜色从淡黄色至橘黄色,长约1mm,触角、足、眼睛退化,体表分布多种腺体及刚毛。雌虫产卵时,围阴腺分泌蜡丝保护卵粒,防止粘连;产卵后,虫体缩向头部,干瘪死亡;卵呈椭圆形,粉色至橘粉色。初孵若虫呈藕粉色,扁椭圆形,光学显微镜下可清楚看到一龄若虫的眼、触角、足、尾丝的形态;触角6节,两眼间有两个腺孔明显,腹末有2根尾丝。二龄若虫的眼、触角、足、尾丝全部退化,外部形态与雌成虫基本相似,但是,围阴腺还未形成。2、在采集的桑白盾蚧上观察发现自然感染死亡的虫体,虫体自然感染真菌各时期的体色不同,分别为:感染初期发白、感染中期棕黄色、感染后期棕褐色,虫体表面附有菌丝;发病初期和中期的虫体还能看出明显具有体液,发病后期变的干瘪。用接种环直接取自然感染死亡虫尸上的真菌孢子,划线培养于平板培养基上,经过多次分离纯化,得到一株菌丝为白色的病原真菌,命名为:TYL001菌株。利用TYL001菌株制备孢子悬浮液(1.0×10~8孢子/mL),对桑白盾阶雌成虫作回接杀虫实验,结果显示,蚧虫体表出现与自然染菌死亡虫尸同样的症状。说明TYL001菌株是致死桑白盾蚧的病原真菌。TYL001菌株的形态特征:分生孢子梗着生于菌丝上,多为单生,少量对生,轮生结构很少出现,刚长出的孢子以粘连球状着生于分生孢子梗上,成熟后,以单个孢子存在。据此形态特征,鉴定该菌株属于虫草科Cordycipitaceae。TYL001菌株的序列测定与分子鉴定:测定的三条序列在NCBI网页上进行Blast比对,ITS序列与Simplicillium sp.(序列号:FJ948132)的相似率为99%;rns序列与Simplicillium lanosoniveum(序列号:EF513006)的相似率为97%;nad3序列与Simplicillium lanosoniveum(序列号:EF512887)的相似性为92%。结合形态学特征和分子鉴定结果,确定TYL001菌株为Simplicillium lanosoniveum。3、5种浓度的孢子悬浮液感染桑白盾蚧后,感染率随孢子浓度的增加依次为:80%、83.33%、86.67%、90%、93.33%,感染中时随孢子浓度增加依次为:10~1.1 h、95.0 h、94.2 h、85.5 h、82.5 h。感染过程与病理学:用TYL001菌株的孢子悬浮液(1×10~8孢子/mL)侵染桑白盾蚧雌成虫,分生孢子最易附着在口器、背管、阴门、围阴腺、肛门及臀板节间处;孢子萌发形成芽管,再形成菌丝,菌丝可以从与外界相通的口器、背管、阴门、围阴腺、肛门等部位侵入,或利用其机械压力和自身分泌的胞外酶的作用,穿透桑白盾蚧体壁;菌丝进入血腔后,感染血细胞和肌肉等组织,大量生长、繁殖;待虫体内的营养耗尽,菌丝冲破体壁,扩散到体表,整个虫体被菌丝覆盖。TYL001菌株在盾蚧体壁培养液培养6 d后,三种胞外酶酶活性均表现先升高后降低的趋势,脂肪酶酶活在第2d达到最大值,Pr1酶酶活在第3d达到最大值,几丁质酶酶活在第4d达到最大值。