淫羊藿总黄酮对SAMP6小鼠成骨细胞基于Wnt/β-catenin信号通路的影响

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研究目的:通过观察淫羊藿总黄酮(total flavonoids of epimedium,TFE)对SAMP6小鼠成骨细胞关键信号通路Wnt/β-catenin上信号靶点的影响,探究TFE防止骨质疏松症(osteoporosis,OP)的作用机制。研究方法:采用机械分离法分离新生SAMP6小鼠的颅骨,酶消化法培养SAMP6小鼠成骨细胞,经碱性磷酸酶染色和瑞氏-姬母萨染色观察SAMP6小鼠成骨细胞的形态,茜素红染色出现钙化结节来鉴定SAMP6小鼠成骨细胞。鉴定成功后取第3代成骨细胞分为对照组及实验组(含TFE1ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)。分别加入对应浓度的TFE培养液培养48h后,分别采用RT-PCR和Western Blot检测β-catenin、Runx2、cyclin D1 m RNA及蛋白的表达。研究结果:本次实验SAPM6小鼠成骨细胞生长曲线:13 d是SAMP6小鼠成骨细胞潜伏适应期,37 d进入细胞对数生长期,之后变为平台期。体外培养的SAMP6小鼠成骨细胞经R-J染色后镜下观察显示胞浆呈现蓝色颗粒,细胞核被染成紫褐色,平均有13个核仁。ALP染色镜下观察可见到胞浆内分布紫红色颗粒,茜素红染色肉眼和镜下均可见被染成橘红色的钙化结节,表明分离培养的SAMP6小鼠细胞是实验需要的成骨细胞。研究发现不同浓度的TFE均可以促进SAMP6小鼠成骨细胞增殖,实验各组成骨细胞的OD值均高于对照组成骨细胞的OD值,且差异具有统计学意义(P<0.01),以含20ug/ml浓度的TFE培养液对SAMP6小鼠成骨细胞增殖作用最显著。RT-PCR检测结果显示实验各组的SAMP6小鼠成骨细胞中β-catenin、Runx2、cyclin D1的m RNA表达水平与对照组相比均明显上调,且差异具有统计学意义(P<0.01)。Western Blot检测结果显示实验组SAMP6小鼠成骨细胞中的β-catenin、Runx2以及cyclin D1的蛋白含量与对照组比较均具有明显提高,且差异具有统计学意义(P<0.01)。研究结论:体外培养得到的SAMP6小鼠细胞经鉴定后具有一般成骨细胞的特征。TFE能促进SAMP6小鼠成骨细胞的增殖,并且促进β-catenin、Runx2以及cyclin D1 m RNA及蛋白的表达,以TFE药物浓度20ug/ml作用最显著。并推测TFE可能是通过Wnt/β-catenin信号通路来促进SAMP6小鼠成骨细胞增殖。
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