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成骨细胞是骨质疏松(osteoporosis)研究的重要平台,骨质疏松的病理改变是成骨细胞Ⅰ型胶原分泌减少、钙结节形成减少。随着我国老龄化社会的到来,骨质疏松症的防治已成为本世纪骨科领域重要研究课题之一。而在骨代谢异常众多影响因素中,近几年关于铁代谢与骨代谢的研究非常令人鼓舞和欣喜。铁调素(Hepcidin)是2001年Park等人首次从人尿中分离出的一种多肽,多项研究认为Hepcidin可以作为“激素样物质”调节铁代谢。本项目主要研究细胞外Hepcidin干预成骨细胞(hFOB 1.19)内铁钙离子转运情况,在细胞水平以铁离子、钙离子为载体探究“Hepcidin”、“铁代谢”、“骨代谢”三者的相互关系,为最终运用Hepcidin或其拮抗剂干预甚至治疗骨质疏松提供实验依据。本研究使用Hepcidin干预成骨细胞后,观察细胞内的铁离子及钙离子的变化情况,并对干预后细胞内的铁离子变化的机制进行探讨。因此,本研究主要分为以下三个部分:第一部分:铁调素(Hepcidin)对成骨细胞内铁离子转运的影响目的研究不同时间和不同浓度Hepcidin对人成骨细胞(hFOB 1.19)内铁离子影响。方法使用Hepcidin干预hFOB 1.19细胞后,采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察成骨细胞内的铁离子荧光强度。结果1.瞬时组:实验组与对照组铁离子强度均出现缓慢下降,二者之间变化趋势无明显的差异。2.长时间组:在0-100 nmol/L范围内,细胞内铁离子荧光强度随着Hepcidin浓度增加而逐渐增强,当Hepcidin的浓度超过100 nmol/L时,细胞内的铁离子荧光强度不再随着Hepcidin浓度的增加而改变。结论1.Hepcidin对hFOB 1.19内铁离子瞬时转运的作用没有明显影响。2.Hepcidn干预hFOB 1.19细胞20小时后有升高细胞内铁离子含量的作用,并且在0-100 nmol/L范围内具有剂量依赖性。第二部分:Hepcidin对成骨细胞内钙和铁离子瞬时影响的研究目的研究Hepcidin对人成骨细胞(hFOB 1.19)内钙离子和铁离子转运的瞬时影响以及钙离子与铁离子转运的相互关系。方法使用Hepcidin干预hFOB 1.19细胞后,分别进行钙离子和铁离子荧光染色,在激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)下选定细胞后,连续观察细胞内的铁离子以及钙离子荧光强度的变化情况。结果1.细胞内的钙离子荧光强度在加入Hepcidin后形成一个瞬时的钙波,钙离子荧光强度增幅最大约为34%,而对照组钙离子荧光强度呈现一个缓慢下降的趋势,二者变化趋势有着明显差异。2.细胞内的铁离子荧光强度在加入Hepcidin后呈现缓慢下降的趋势,与对照组内的铁离子荧光强度变化趋势相类似,无明显差异。结论1.Hepcidin有促进钙离子向hFOB 1.19内瞬时转运的作用。2.Hepcidin对hFOB 1.19内铁离子瞬时转运的作用没有明显的影响。3.Hepcidn促进钙离子向hFOB 1.19内瞬时转运是非铁离子依赖性的。第三部分:膜转铁蛋白1在成骨细胞上表达及意义目的研究膜转铁蛋白1(Ferroportin,FP1)在人成骨细胞(hFOB1.19)膜上的表达情况和膜转铁蛋白1的配体Hepcidin对成骨细胞内铁离子的影响。方法成骨细胞常规方法培养后,用RT-PCR的方法测定膜转铁蛋白1基因的表达。用Hepcidin干预细胞后,激光共聚焦显微镜观察细胞内的铁离子变化情况。结果RT-PCR显示:膜转铁蛋白1基因在成骨细胞内呈阳性表达;激光共聚焦显微镜结果显示:对照组铁离子荧光强度是7.21±2.78(A0组),Hepcidin干预组铁离子荧光强度是分别是20.85±5.40 (A1组)和35.54±9.23 (A2组)。结论根据实验结果可以推论:膜转铁蛋白1在成骨细胞膜上阳性表达并且具有外排细胞内铁离子作用。