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目前认为,人脑恶性胶质瘤发生的假说是多阶段基因突变学说,即其发生是一个多阶段逐步演变的过程,细胞通过一系列进行性的改变逐渐变成恶性,在这种克隆性演化过程中,常积累一系列的基因突变,可涉及不同染色体上的不同基因的变化,因此寻找新的肿瘤相关基因,并对其主要的异常信号通路进行干预,将可能有效的治疗肿瘤。Dickkopf-l(DKK-1)基因是作为胚胎时期头部形成的诱导子和Wnt信号传导通路的抑制因子首次被发现,并且在不同的恶性肿瘤中作用不一。目前国内外关于DKK-1在胶质瘤发病过程的作用及机理研究较少,因此我们通过体外转染DKK-1于人脑胶质瘤细胞系并对其进行功能研究。本课题从两个方面对DKK-1进行研究:①构建人源DKK-1的真核表达载体。②体外通过脂质体介导转染人脑胶质瘤细胞系SHG44,观察稳定转染后DKK-1对SHG44的生物学活性的影响。第一部分人源Dickkopf-1真核表达质粒的构建目的构建人源Dickkopf-1(DKK-1)基因的真核表达质粒,为进一步研究DKK-1的生物学功能奠定基础。方法Trizol法从人新鲜胎盘组织中抽提总RNA, RT-PCR法反转录为cDNA,以cDNA为模板扩增人源DKK-l的基因序列,将经NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的真核表达载体pcDNA3.1和DKK-l的PCR产物用T4连接酶连接,将连接产物转化至感受态大肠杆菌后经菌落PCR, NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切及基因测序鉴定。结果RT-PCR法从人胎盘中扩增出816bp大小的目的片段,重组质粒转化至大肠杆菌后经菌落PCR同样扩增出816bp大小的目的片段,NHeⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒均能切出两条相应目的条带,测序后与genebank中DKK-1的cDNA进行对比,证明DKK-1的基因序列完全正确。结论成功构建了pcDNA3.1-DKK-l重组质粒,为研究人源DKK-1的功能奠定了基础。第二部分Dickkopf-1基因的表达及其对SHG44的作用目的体外研究转染DKK-1对人脑胶质瘤细胞系SHG44的生物学活性的影响。方法以Lipofectamine 2000介导将重组质粒pcDNA3.1-DKK-l转染入人脑胶质瘤细胞系SHG44,经G418筛选后扩大培养,用PCR、RT-PCR和Western blot法分别在DNA、mRNA、蛋白水平进行检测,然后用BCNU处理转染后的SHG44细胞及对照组细胞,经AVF+PI双染后经流式细胞仪检测各组细胞的变化。结果重组质粒和空载体转染的SHG44细胞经G418筛选及扩大培养后,经PCR、RT-PCR、Western blot检测发现:重组质粒转染组细胞在DNA、mRNA、蛋白水平分别表现出相应的明显条带,而对照组细胞的DNA和蛋白均未显示相应条带,在mRNA水平仅表现了微弱条带。流式细胞术检测经BCNU处理后的各组细胞的凋亡率发现:未转染SHG44细胞、空质粒转染细胞、重组质粒转染细胞的平均凋亡率分别为1.0%、1.4%、8.0%。结论建立稳定表达DKK-1蛋白的胶质瘤细胞系SHG44命名为SHG44-DKK-1。DKK-1蛋白能增加胶质瘤细胞SHG44对BCNU的敏感性。