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自上个世纪七十年代以来,科学家们一直致力于探索基因组的编辑技术。随着1996年的锌指核酸酶(Zinc-Finger Nuclease,ZFN)和2009年的转录激活效应因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALEN)相继发现并作为基因编辑手段进行应用,在基因组和基因功能相关研究方面取得了许多重要发现和进展。而在2013年,成簇的、规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9)技术的出现,开启了基因组编辑技术研究新的阶段。CRISPR/Cas9及其衍生物作为当今研究最火热的编辑手段,其突变效率高,易于操作的特点使其目被广泛用于应用于多个模式生物的基因功能研究和目标疾病治疗中,为生命科学的发展带来了革命性的变化。然而,目前对Cas9编辑结果的理解尚存在许多未解谜题。目前普遍认为CRISPR/Cas9编辑后,会在打靶位点产生随机碱基插入或缺失(indel),除人为引入外源DNA产生同源重组(HDR)是精准修复外,其他的修复方式,比如非同源末端连接(NHEJ)都是随机并且不可预测的,但也有科学家提出无论何种修复途径其结果都是有规律的。本研究结果通过深度测序揭示家蚕CRISPR/Cas9编辑后的规律性,即通过对来自16个个体中9个sgRNA靶位点的总共31161个编辑事件进行分析,结果发现Cas9编辑产生的突变是非随机可以预测的;结合细胞实验,也同样发现Cas9编辑产生的缺失序列更多出现在打靶位点的上游,本研究为深入地理解Cas9介导的突变,更好地为CRISPR/Cas9编辑实验的设计提供理论和技术支持,通过进一步研究,获得的具体结果如下:1.家蚕CRISPR/Cas9编辑效率和突变类型具有差异性显微注射Cas9和所设计的靶位点sgRNA复合物后选择16个具有表型的个体进行统计,个体编辑效率范围为2.16%-13.15%,三种突变类型:中小片段缺失、部分碱基替换和部分碱基插入平均占比分别为65.55%、6.77%和13.26%。进一步对9个打靶位点的indel情况进行统计,结果发现缺失突变类型主要以单个碱基缺失为主,而在修复时,除此之外,当打靶位点存在微同源序列时,修复倾向以微同源末端连接的方式修复,这种倾向性与同样方法分析斑马鱼和人的CRISPR/Cas9突变编辑结果是一致的。另外,对每个靶位点的插入序列的分析,发现1、6和8个碱基的插入序列占总插入序列数的51.36%,进一步对插入的单个碱基进行分析,结果发现T碱基是插入最多的碱基,占总的单碱基插入序列的47.50%。碱基插入可能是由多种机制,包括直接获取游离基因组片段、复制断裂末端、复制相邻序列和随机添加游离核苷酸形成的。通过对不同个体不同sgRNA分析和比较,发现家蚕CRISPR/Cas9编辑效率和突变类型因sgRNA序列、方向和个体而异。2.CRISPR/Cas9编辑范围是非随机且可预测的通过对16个个体的9个打靶位点突变序列的突变类型进行分析,发现突变序列比例高的突变类型同时出现在多个个体中,比如sgRNA9:CATACTACAGATACTTTCTT打靶位点,排名前三的突变分别为缺失4、21、3个碱基的突变类型,这三种突变类型在16个个体当中都存在,而在不同个体当中,比例分别高达75.47%、69.06%、59.33%。对9个打靶位点排名前200的突变类型进行突变序列比例计算和同时出现的个体数量进行统计,发现排名靠前的部分突变类型,其突变序列所占比例高,且在多个个体均存在,这与sgRNA9上得到的结果一致。此外,对排名前20的突变类型进行计算,发现这些突变类型的序列占总突变序列的83.07%,而同时存在于13个个体及以上的突变序列占总突变序列的53.99%。我们发现单一靶位点突变类型主要受到打靶位点序列影响,所以在设计sgRNA时就可以预测打靶位点的修复结果。3.CRISPR/Cas9介导家蚕缺失序列倾向靶位点上游缺失为了得到高效率的CRISPR/Cas9编辑结果,进一步设计了4个不同打靶基因的sgRNA,并将其分别与Cas9共转染至家蚕BmE、BmNs和BmN-sidI三种细胞系中,获得的细胞编辑效率的范围为18.83%-57.30%,单端缺失序列占总突变序列的比例范围为46.77%-88.43%,打靶位点上游缺失序列占单端缺失序列的比例范围为69.44%-97.22%,平均为80.38%。与自NCBI上下载并分析的人(42.65%)、小鼠(48.39%)、斑马鱼(31.48%)的数据相比,家蚕的打靶位点具有明显的倾向靶位点上游缺失的特殊倾向性。此外,对单一细胞系不同打靶位点和不同细胞系单一打靶位点的重合度进行分析,发现后者的重合度更高,说明在细胞水平,CRISPR/Cas9修复也是非随机的,且修复主要受打靶位点序列的影响。这也反映了家蚕与其他物种CRISPR/Cas9介导的编辑结果整体修复具备一致性,而打靶位点缺失具备特殊性。这一研究结果将为家蚕基因组编辑实验提供新设计思路和可预测的编辑实验结果,也将为对家蚕DNA修复通路的研究提供参考。