【研究目的】Twist蛋白是一种含有碱性螺旋环螺旋（bHLH）结构的转录因子，在进化过程中高度保守，包括Twist1和Twist2。Twist1与Twist2的结构有66%的相似度，并且在bHLH区域相似度高达98%，但其功能并不一致。Twist蛋白在多种实体瘤中表现为潜在的致癌性，包括调控AKT2的表达、促进细胞上皮至间充质转换(EMT)的发生，在肿瘤细胞的迁移,侵袭和转移中起作用。Twist在血液系统疾病中的作用与实体瘤不同，在Twist2-/-小鼠髓系细胞过度增殖，有骨髓增殖性疾病（MPD）的表现，说明Twist2对小鼠骨髓粒系细胞生长呈负调节作用，故我们认为TWIST2在髓系白血病中可能起到抑癌基因的功能，为进一步验证我们的假设，首次揭示TWIST2在髓系白血病中的作用，我们进行了一系列基础研究，希望能为髓系白血病的治疗提供新的思路。【研究方法】收集急性髓系白血病患者骨髓5～10ml，Ficoll分离提取单个核细胞，同时收集急性髓系细胞系（Raji、Dami、THP-1、SHI-1）细胞，提取基因组DNA,采用重硫酸盐限制性内切酶法（COBRA）检测DNA样本甲基化程度；直接测序法检测TWIST2基因启动子区域13个CpG位点的甲基化；免疫磁珠分选髓系白血病患者CD34+细胞，包括AML30例，CML14例，正常对照6例，相对实时定量PCR（Q-RT-PCR）检测各组TWIST2表达量；构建TWIST2慢病毒载体，磷酸钙沉淀法制备表达VENUS对照及TWIST2基因的慢病毒，细胞生长曲线和集落生成实验检测VENUS和TWIST2对AML细胞株THP-1和Dami以及CML细胞株MEG-01和K562中的增殖能力影响；富集AML和CML患者CD34+细胞，过表达VENUS和TWIST2，检测VENUS和TWIST2对原代造血干细胞的影响；在THP-1细胞中过表达VENUS和TWIST2，两组裸鼠皮下注射一定量细胞，检测细胞的成瘤能力，体内实验验证基因的功能；为探讨TWIST2抑制细胞增殖的机制，FACS检测4个细胞系两组细胞的周期进程，为进一步研究TWIST2基因作用的分子机制，采用点突变及PCR的方法构建TWIST2的4种突变体，包括TWIST2蛋白N端缺失（28个氨基酸）、C端缺失（20个氨基酸即Twist Box）、basic区域突变（74、75、76、78位的碱性氨基酸或酸性氨基酸突变为丙氨酸）、HLH区域突变（86位苯丙氨酸突变为脯氨酸），磷酸钙沉淀制备含突变体的慢病毒，并Western Blot （WB）检测突变体的表达；K562细胞中检测TWIST2及其突变体对细胞的增殖能力及集落生成能力的影响，FACS检测其对细胞周期的影响，发现其可能的重要功能结构域；富集4例CML患者CD34+细胞，在原代造血干细胞中检测VENUS、TWIST2、TWIST2F86P对细胞集落生成的影响，进一步验证HLH功能结构域的重要性；为研究TWIST2与伊马替尼的相互作用，加入不同浓度IM，检测K562细胞的集落生成数目；为进一步探讨TWIST2作用的靶基因，首先Microarray分析比较THP-1/VENUS细胞和THP-1/TWIST2细胞的差异表达基因，进一步在K562及CMLCD34+细胞中用Q-RT-PCR验证与白血病/肿瘤/造血发生相关的部分差异表达基因，CHIP方法检测K562细胞中TWIST2直接作用的靶基因，克隆P21的启动子区域，luciferase双报告基因方法检测靶基因P21的转录活性；【研究结果】①收集20例急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞及4个细胞系细胞，COBRA检测TWIST2甲基化程度，其中Raji、Dami、THP-1及部分患者甲基化程度较正常健康志愿者明显增高，说明TWIST2在急性髓系白血病患者中甲基化程度及比例增高；异常高甲基化导致基因转录沉默，为此我们收集30例AML及14例CML患者CD34+细胞，Q-RT-PCR检测到AML、CML患者TWIST2的表达与正常对照组比较降低，两组分别与正常对照比较都有统计学差异（P<0.05）；②构建过表达TWIST2的慢病毒载体，比较对照VENUS及TWIST2对髓系细胞（THP-1、Dami、K562、MEG-01）的增殖影响，结果显示在4个细胞系中TWIST2都能抑制细胞生长，两组比较均存在统计学差异（P<0.05）；对于单个细胞的集落生成实验中也观察到同样的现象，TWIST2对原代造血干细胞的集落生成亦存在抑制作用，CML中VENUS组与TWIST2组比较有统计学意义（P<0.05）；③体外实验我们已经证实TWIST2对细胞的抑制作用，进一步体内实验表明对照VENUS组裸鼠成瘤能力明显高于TWIST2组，两组（VENUS组与TWIST2组）比较存在统计学差异（P<0.01）；④体内及体外实验均证明TWIST2有抑制作用，进一步FACS检测TWIST2对细胞周期的影响，结果显示在4个细胞系中，TWIST2都能抑制细胞G1-S期转换，在TWIST2组细胞被阻滞在G0/G1期，细胞分裂受阻，3次独立重复试验两组（VENUS组与TWIST2组）比较存在统计学差异（P<0.05）；⑤为进一步探讨TWIST2作用的分子机制，构建TWIST2突变体，细胞增殖及集落生成实验结果均提示TWIST2抑制K562细胞生长依赖bHLH区域，N-和C-并不是必需的区域；富集CMLCD34+细胞，VENUS、TWIST2、TWIST2F86P慢病毒转染细胞，接种CD34+细胞到含细胞因子的半固体甲基纤维素培养基，集落生成实验结果提示TWIST2可以抑制CMLCD34+细胞的各种集落生成，而TWIST2F86P组集落数目明显增多，VENUS组及TWIST2F86P组分别与TWIST2组比较均存在统计学差异（P<0.05），进一步说明HLH区域是TWIST2抑制细胞生长的重要功能结构域；⑥FACS检测TWIST2及其突变体对K562细胞周期的影响，结果表明TWIST2F86P及VENUS与TWIST2比较有统计学差异（P<0.05），G0/G1期细胞阻滞消失；⑦IM处理转染TWIST2及其突变体的K562细胞，结果显示过表达TWIST2可以增强K562细胞对IM的敏感性；⑧为进一步探讨TWIST2的作用机制，Microarray分析到THP-1/VENUS和THP-1/TWIST2之间的差异表达基因共662个，Q-RT-PCR验证与造血及肿瘤相关的基因15个，K562细胞和CMLCD34+细胞过表达TWIST2后Q-RT-PCR检测相关差异表达的基因，P21及ID2的表达增高，TERT及CCND1的表达降低；CHIP检测TWIST2的靶基因，结果显示TWIST2组ID2、P21、CCND1基因的富集，是TWIST2的靶基因；克隆细胞周期相关基因P21的启动子，luciferase检测发现TWIST2组P21的转录活性明显比VENUS组和TWIST2F86P组高，P21是TWIST2的直接作用靶基因，TWIST2调控P21的转录活性。【结论】综上所述，急性髓系白血病患者中TWIST2启动子区域甲基化程度增高，而正常对照无甲基化。因为TWIST2启动子区域的高甲基化导致基因的表达沉默，故AML及CML CD34+细胞中TWIST2的表达与正常对照比较表达降低。过表达TWIST2发现TWIST2抑制髓系细胞系及原代CD34+细胞的增殖，细胞周期进程受阻，细胞阻滞在G0/G1期。TWIST2抑制髓系细胞系及原代CD34+细胞生长的功能结构域为bHLH区域，N-和C-并不是必需的区域。TWIST2可以增强K562细胞对伊马替尼（IM）的敏感性。CML中TWIST2作用的靶基因是P21、CCND1、ID2，证实TWIST2增强靶基因P21的转录活性。