目的石墨烯(Graphene)是世界上最薄的新型二维纳米材料,厚度仅为0.35nm(约为头发直径的二十万分之一)。石墨烯优异的电学、力学和热学性质使其在复合材料、传感器、能源等领域具有重要的应用前景,成为近年来纳米领域研究的热点,石墨烯的发现者Geim和Novoselov也因此而获得了2010年诺贝尔物理学奖。石墨烯在生物医学领域的研究是近两年才开始的,在生物医学领域应用较多的石墨烯衍生物主要是氧化石墨烯(Graphene Oxide, GO),它的结构与石墨烯大体相同,只是在二维基面上连有一些含氧官能团,如羟基、羰基、羧基等。这些氧化官能团的存在使得GO具有良好的生物相容性、亲水溶液稳定性、与聚合物的兼容性等特性。同时有利于化学功能化修饰,以达到在不同领域(特别是生物医学领域)应用的目的。目前已有学者研究了GO在载药体系、生物检测、生物成像、肿瘤治疗以及它们在生物安全性方面的研究。其中在生物检测这方面,利用GO可对DNA、RNA和蛋白质等进行检测。在检测中,GO发挥以下两方面的作用：一是作为载体,二是它具备对荧光基团淬灭的特性。本文将利用GO对PML/RARa融合基因进行检测,研究GO作为检测工具的准确性如何。PML/RARa融合基因是急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leuke-mia, APL)的标志性基因。APL是一种常伴发严重出血的急性白血病,95%以上的APL发生特异性的染色体易位t(15；17)(q22；q12～21),导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病((Promyelocytic leukemia, PML)基因与17号染色体上的维甲酸受体α (Retinoic acid receptorα, RARα)基因融合产生PML/RARα融合基因。该融合基因在APL早期诊断和预后监测中具有重要意义。目前PML/RARα融合基因检测的方法主要有染色体分析、实时定量RT-PCR、FISH法等,但这些方法均存在主观性强、操作繁琐、检测费用高等问题,限制了其广泛应用。本文利用GO对PML/RARa融合基因检测的原理如下：GO对荧光ssDNA具有很强的吸附能力,并能淬灭其荧光。而与目标分子相遇后,荧光ssDNA可从GO上脱落,淬灭作用解除,荧光得到恢复,从而达到检测目的。方法1.功能化GO的制备1.1GO的制备：制备出生物学适用的100nm左右的GO。1.2GO的功能化：用双氨基聚乙二醇对GO进行功能化。2.荧光分光光度计检测荧光首先,设计荧光探针：本实验中的探针ssDNA是根据PML-RARα融合基因L型三种不同的剪接体中的E5(-)E6(-)剪接体设计的。之所以选择E5(-)E6(-)剪接体为例进行设计,是因为在反式维甲酸治疗后的缓解过程中,在融合基因可观察到的时间范围内,E5(-)E6(-)剪接体存在周期最长,是最后消失的剪接体,它在监测融合基因动态变化中最敏感。用绿色萤光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记ssDNA,制备出荧光探针,本文中检测的荧光均指GFP荧光。然后：制备不同浓度的GO,用荧光分光光度计检测荧光,从而观察不同浓度GO对探针荧光的淬灭功能以及不同浓度目标分子出现后荧光恢复情况。3.细胞培养NB4细胞(实验组细胞,含有PML/RARa融合基因)、K562细胞(对照组细胞,不含PML/RARa融合基因)接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,在37℃,5%CO2条件下培养,2-3天半量换液。实验前进行细胞计数,按实验要求调整细胞密度。4.功能化GO载带荧光探针进入活细胞实验将GO、荧光探针、缓冲液的混合液与NB4细胞和K562细胞共同孵育,用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪进行检测。5.功能化GO载带荧光探针进入打孔细胞实验用白细胞穿孔试剂Ⅰ先将NB4细胞和K562细胞固定,然后白细胞穿孔试剂Ⅱ对其细胞膜进行穿孔。孵育液(分为有荧光探针干预组和没有荧光探针干预组)与NB4细胞和K562细胞孵育1h。最后用激光共聚焦荧光显微镜和流式细胞仪检测。6.功能化GO在APL诊断中的应用研究收集山西医科大学第二医院血液科住院及门诊病例36例,这36例中包括APL初发患者、APL复查缓解者和非APL患者。其中通过PML-RARa融合基因检测,选取到融合基因为L型病例16例,融合基因为非L型的病例20例。分别向骨髓标本中加入CD45、白细胞穿孔试剂Ⅰ、Ⅱ。离心弃上清后,向细胞中加入GO、荧光探针、缓冲液的混合液体,室温下共同孵育1h后,用PBS(1×)缓冲液清洗、离心、通过流式细胞仪检测GFP绿色荧光即PML-RARa融合基阳性的细胞百分数和荧光强度。结果1.功能化GO的制备GO的制备过程中,要历经5d的过程。GO的颜色也会发生变化,从一开始墨绿色到随后的亮黄色,最终得到的棕褐色GO。用SPA300HV扫描探针显微镜对样本进行检测：GO尺寸接近100rnm。对GO用双氨基聚乙二醇进行功能化,然后用FTIR-8400S傅立叶红外光谱表征功能化的GO。生物相容性实验表明,制备出的功能化GO能够在PBS溶液、细胞培养液、血清中稳定存在,在10000r高速离心后仍不会发生团聚。2.荧光分光光度计检测荧光：不同的GO浓度,对荧光探针的淬灭能力不同。本实验中所制备出GO的最佳的浓度为0.04mg/ml。在GO为0.04mg/ml浓度时,浓度由高到低的目标分子100nM、100nM、50nM)出现时,荧光恢复的强度也依次由强到弱。而当GO浓度大于0.1mg/ml时,遇到目标分子荧光不会恢复。3.功能化GO载带荧光探针进入细胞实验：通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测得到结果如下：3.1活细胞实验：本实验没有实现GO载带荧光探针进入活细胞。3.2打孔细胞的实验：NB4细胞为实验组细胞,K562细胞为对照组细胞。当荧光探针干预时,只有NB4细胞会有荧光信号,而K562细胞无荧光信号,说明该方法准确性很好。线性探针和环形探针的运用没有什么太大区别,由于环形探针更加稳定,所以实验选用环形探针。探针浓度分别选用150nM、200nM、250nM。在三种浓度中,探针200rnM效果较为理想。孵育液与细胞孵育1h便可进行检测。样本制备好后,短时间内荧光不会淬灭,检测结果不会受到影响。运用本方法可找到的PML-RARa融合基因阳性细胞数占58.6%以上(P<0.0001)。4.功能化GO在APL诊断中的应用研究运用功能化GO载带荧光探针检测骨髓标本中是否含有L型PML-RARa融合基因。含L型PML/RARa融合基因的细胞在探针干预下出现的荧光信号显著强于不含L型PML/RARa融合基因的细胞(P<0.0001)。经流式细胞术分群后,分别对淋巴细胞、红细胞、早幼粒细胞的荧光强度进行组间比较。实验结果表明不含有L型PML/RARa融合基因骨髓标本中,淋巴细胞、红细胞、早幼粒细胞由于没有L型PML/RARa融合基因,所以即使用探针干预,组间比较也是无差别的(P>0.05)。对于含有L型PML/RARa融合基因的骨髓标本,组间两两比较：淋巴细胞、红细胞荧光强度无差异(P>0.05)；而这两种细胞与早幼粒细胞(含有L型PML/RARa融合基因)荧光强度相比均具有显著性差异(P<0.0001)。在面对未知是否含有PML/RARa融合基因的骨髓标本时,用本检测方法,以荧光强度或荧光阳性细胞百分数作为依据在临床诊断中均具有意义(P<0.05.),诊断准确性分别为92.2%、90.9%。将GO检测法与目前临床中用于PML/RARa融合基因检测的PCR法做统计学比较,在统计学上,两者有差异(P<0.05)。结论1.双氨基聚乙二醇功能化的的小尺寸纳米GO生物相容性好,在生物溶液中不团聚。2、细胞外实验证明GO载带ssDNA荧光探针能够识别目标分子。3.功能化GO能够准确识别NB4细胞株中的PML-RARα融合基因。4.在临床APL诊断的研究中,功能化GO作为载体,载带ssDNA荧光探针能够非常方便、快捷的检测出PML-RARα融合基因；且该方法价廉、无污染。据此理论可以设计不同的探针,利用GO来检测具有任意目标分子的细胞,为临床开展快速、准确的诊断方法提供新的思路。