论文部分内容阅读
黄花蒿（Artemisia annua L.）系菊科（Asteraceae）蒿属（Artemisia）的一年生草本,其叶表面的腺毛中含有抗疟药物——青蒿素（ART）。为了实现黄花蒿中有效成分的高值化加工和利用,本论文从黄花蒿中高效提取青蒿素,利用超声载药法构建了口服果胶-酪蛋白胶束（PC）负载青蒿素药物递送系统（PC-ART）和PC负载青蒿琥酯（AS）药物递送系统（PC-AS）,在对二者进行表征时发现了独特的胶束特征。为评价PC-ART和PC-AS的口服适用性,进行了体内、外及毒性评价。最后,以口服给药的方式治疗系统性红斑狼疮（SLE）小鼠8周并评价PC-ART和PC-AS对SLE的治疗效果。（1）利用超高压辅助烷基糖苷1214（APG1214）（HHPE）提取黄花蒿叶中的青蒿素。研究利用青蒿素柱前衍生化-HPLC法定量分析黄花蒿叶提取物中的青蒿素含量。选择对青蒿素溶解度高、提取率高、价格低廉且环保的绿色溶剂APG1214,利用单因素法和响应面法分析优化提取条件,得到HHPE提取青蒿素的最优条件为:物料粒度为82目,料液比为1:27,APG1214浓度为7.30%,提取压力为316 MPa。在此条件下青蒿素的理论得率为6.96 mg/g,实验验证青蒿素的实际得率为6.78±0.13 mg/g,二者基本一致,表明模型的可靠性。利用乙酸乙酯分离和乙醇重结晶最终得到青蒿素粗晶（纯度为78.66%）。此外,APG1214的可重复利用特性证明了HHPE提取法的高效性和环境友好型。（2）探索HHPE从黄花蒿叶中提取青蒿素的机制。其中,比较了HHPE、水热提取、超声波提取、微波提取的提取效率和能量消耗,结果显示,高压辅助APG1214在最优条件下提取得到青蒿素89.18±1.65%,是正己烷提取的1.19倍,超声波提取的1.34倍,微波提取的1.27倍。然而,HHPE的能耗仅为索氏提取和正己烷提取的1/52,是超声和微波提取的1/14.4。利用密度泛函理论发现APG1214和青蒿素通过氢键结合成超分子。此外,利用提取动力学模型揭示了HHPE提取青蒿素的过程主要是快速洗涤,伴随着缓慢扩散,导致提取后储存青蒿素的腺毛变形和破损。因此,HHPE可以成为一种绿色、可持续、低成本的天然产物提取替代方案,为工业应用提供理论基础。（3）利用超声载药法构建口服PC负载青蒿素药物递送系统（PC-ART）和PC负载青蒿琥酯药物递送系统（PC-AS）。利用碳二亚胺反应合成PC载体并对其进行了表征。结果表明,红外光谱中酰胺键振动的强度增强和临界胶束浓度（CMC）的形成证明果胶和酪蛋白合成酰胺键。利用超声载药法建立口服的PC-ART和PC-AS。单因素结果显示,果胶和酪蛋白的质量比为1:1、乙醇的百分含量为60%、超声载药时间为5 min、超声载药功率为180 W、PC载体的质量与青蒿素的质量比为20:2时,PC-ART的载药量和包封率均达到峰值,其中最高值为载药量9.05%,包封率85.94%。对于PC-AS,当果胶和酪蛋白的质量比达到1:2、乙醇百分数10%、超声载药时间20 min、超声功率300 W、PC载体的质量与青蒿素的质量比20:20时,PC-AS的载药量和包封率均达到峰值,载药量为49.43%,包封率为88.87%。最后,对PC-ART和PC-AS进行了表征,我们发现PC-ART（PC（1:1）=160 nm,PC-ART=100.2 nm）和PC-AS（PC（1:2）=202.4nm,PC-AS=104.2 nm）载药后出现粒径减小的行为,证明脂溶性青蒿素或青蒿琥酯被胶束包裹于疏水内核,改变了胶束内部的相互作用力。此外,分散于蒸馏水中的纳米粒子（PC-ART=100.2 nm,PC-AS=104.2 nm）由于水合层的存在其粒径大于干燥后的纳米粒子（二者均为60 nm）。FTIR和XRD结果表明,PC以胶束的形式将青蒿素和青蒿琥酯负载于胶束的中心,使青蒿素和青蒿琥酯在胶束表面的特征峰被掩盖。（4）利用稳定性、饱和溶解度和释放等体外评价和生物利用度的体内评价分析PC-ART和PC-AS的口服适用性。利用斑马鱼和人克隆结肠腺癌细胞（Caco-2）细胞对PC-ART和PC-AS进行安全性评价。其中,利用斑马鱼进行成鱼急性毒性试验、斑马鱼成鱼长期毒性试验,利用Caco-2进行细胞毒性试验。体外评价结果表明,PC-ART和PC-AS冻干粉在蒸馏水中分散状态良好,10天内的粒径大小和Zeta电位均无显著性变化,较稳定。果胶-酪蛋白胶束负载的青蒿素和青蒿琥酯药物递送系统水溶性的提高使PC-ART和PC-AS在去离子水、人工胃液和人工肠液的饱和溶解度均高于原药。而且,PC-ART和PC-AS在人工胃液和人工肠液中以胶束的形式存在,这在体外溶出实验中表现为PC-ART和PC-AS在人工胃液和人工肠液中较少的青蒿素和青蒿琥酯溶出,而原药的溶出水平均高于PC-ART和PC-AS。生物利用度实验结果表明PC-ART和PC-AS提高了原药的生物利用度,果胶-酪蛋白胶束药物载药系统促进了药物的吸收、分布和消除。毒性结果显示,96 h内PC-ART和PC-AS对斑马鱼成鱼没有造成显著性的伤害。28天的长期毒性试验中,PC-ART和PC-AS对斑马鱼成鱼的肝脏损伤程度小于原药。而且,PC-ART和PC-AS对斑马鱼产生的氧化应激程度小于青蒿素和青蒿琥酯。此外,经过PC-ART和PC-AS处理的Caco-2细胞仍然保持着较高的细胞活力。以上结果证明PC-ART和PC-AS的安全性。（5）给予SLE模型小鼠（MRL/lpr小鼠）连续8周口服PC-ART和PC-AS,并在实验期间监测体重、生理状态和尿蛋白等指标。实验结束后,采集血浆和制备10%肾组织匀浆液用于检测SLE标志性抗体和炎性因子,制作肾脏病理切片以观察肾损伤程度和免疫复合物沉积。结果表明,在给药期间,PC-ART和PC-AS抑制了MRL/lpr小鼠因腺体增大导致的体重上升,有效降低了尿蛋白水平。而且,血液中血肌酐（Cre）和血尿素氮（BUN）含量的降低表示肾功能的恢复,SLE标志性抗体（抗核抗体,ANA;抗双链DNA抗体,ds DNA-Ab）和炎性细胞因子（白细胞介素6,IL-6;γ干扰素,IFN-γ）水平的降低昭示了SLE病症的缓解。此外,PC-ART和PC-AS减轻了MRL/lpr小鼠的肾损伤和免疫复合物Ig G的沉积。综上所述,PC-ART和PC-AS可有效减轻SLE标志性抗体和炎症因子水平,减轻肾损伤和免疫复合物沉积,恢复肾功能,减少尿蛋白水平,对SLE的治疗具有积极作用。简言之,以果胶-酪蛋白为胶束外壳的PC-ART和PC-AS,改善了原药的稳定性、水溶性和生物利用度,有利于口服给药并缓解SLE的病症。综上所述,利用一种高效环保、可持续的HHPE获得黄花蒿叶中的青蒿素,并将青蒿素及其衍生物青蒿琥酯利用PC制备为水溶性好、生物利用度高的口服药物,应用于SLE的治疗中,使黄花蒿活性成分得到高值化加工利用,也为植物有效成分的提取及临床医学提供一定的数据支持。