粘质沙雷氏菌plaS基因编码的辅助蛋白能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道。本文通过对磷脂酶A1辅助蛋白S(PlaS)生物信息学分析及其N端截短系列表达菌株的生长特性研究来确定其抑制作用关键区域,并通过扫描电镜(SEM)观察和流式细胞仪(FCM)检测来初步探究其抑制机理。同时通过酵母双杂交,Biacore蛋白互作实验,以及对共表达菌株dB27P28(磷脂酶A1与N段截短27个氨基酸的辅助蛋白共表达)磷脂酶A1酶活测定,来研究截短后的辅助蛋白对磷脂酶A1的影响。主要研究内容与结果如下:(1)通过对PlaS信号肽,跨膜区,疏水区分析后,决定在PlaS的N端分别截短23、24、25、26、27个氨基酸,并将截短后的辅助蛋白基因分别导入到大肠杆菌BL21(DE3)中。在构建的表达菌株中,dS23P28、dS24P28、dS25P28、dS26P28菌株仍表现出不同程度的生长抑制现象,而dS27P28菌株没有出现生长抑制现象,初步表明PlaS的N端前27个氨基酸为生长抑制关键区域。(2)将SP28(辅助蛋白S基因导入到大肠杆菌BL21(DE3)中表达),dS27P28菌株诱导表达后进行扫描电镜观察,同时以P28菌株为对照,发现PlaS的表达对大肠杆菌的细胞膜有严重的损伤现象,而从N段截短27个氨基酸的PlaS表达后对大肠杆菌细胞膜损伤作用消失,同时流式细胞仪数据也显示在SP28菌株诱导表达8h时细胞膜损伤率达到了 66.92%。这些结果与生长特性结果一致。(3)利用酵母双杂交技术构建了诱饵质粒pGBKT7-PLA1和猎物质粒pGADT7-dP1aS27,并将二者共转进Y2H Gold酵母细胞中。将共转细胞涂布于TDO/3’AT 20mM和QDO平板能生长,这说明激活报告基因HIS和ADE2表达,所以PLA1蛋白和dPlaS27蛋白之间体内有相互作用。将PLA1蛋白和dPlaS27蛋白进行纯化,随后将得到的纯蛋白在Biacore蛋白互作仪进行二者互作实验来判断二者间的相互特性,结果表明蛋白PLA1与蛋白dPlaS27能够特异结合,并呈现很好的浓度依赖,说明磷脂酶PLA1蛋白与辅助蛋白dPlaS27间在体外存在相互作用。(4)构建了磷脂酶A1与N段截短27个氨基酸的PlaS共表达菌株dB27P28,并与实验室先前构建的磷脂酶A1与PlaS共表达菌株BP28的磷脂酶A1的酶活相比较。发现酶活有很大提高,说明辅助蛋白截短27个氨基酸后没有改变磷脂酶A1的功能,且有助于提高磷脂酶A1的活性。并且对共表达菌株dB27P28初始诱导细胞OD600值,诱导时间和加入IPTG浓度三个方面进行了酶活优化,采用3因素3水平的正交实验,结果得出在菌株生长到OD600为0.6时加0.15mmol/L的IPTG进行诱导8小时酶活达到较高水平。本实验结果对深入研究粘质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白PlaS功能提供理论基础。