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近年来,J亚群禽白血病病毒(ALV-J)和禽网状内皮组织增生症病毒(REV)共同感染和协同致病的现象广泛发生,给我国养禽业带来了严重的损失,然而,关于ALV-J和REV协同感染的机制尚不明了。Exosome是由细胞分泌的一种功能性小囊泡,它通过调节特异性蛋白质、脂质、核酸等的分泌,参与体内多种的生理和病理过程。Exosome为我们研究ALV-J与REV协同感染机制提供了新思路。本研究在证明ALV-J和REV具有协同感染能力的基础上,拟通过分析共感染ALV-J+REV细胞分泌的exosome的蛋白质组学和转录组学(mi RNA),揭示ALV-J和REV共同利用的细胞通路,从而初步阐明ALV-J与REV协同感染机制,为联合防控及其它病毒间协同感染机制研究奠定科学基础。将ALV-J-NX0101病毒和REV-SNV株病毒接种无特定病原体(SPF)鸡胚分离的鸡胚成纤维细胞,设置4个实验组:ALV-J+REV组,ALV-J组,REV组,和无病毒空白对照组。经PCR、间接免疫荧光(IFA)和禽白血病抗原(p27)检测接毒成功后,以荧光定量PCR方法从病毒转录层面证明ALV-J和REV协同感染,结果显示在感染72h内,共同感染组中ALV-J和REV的RNA转录水平均高于单独感染组;通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察发现,ALV-J和REV共同感染组REV蛋白表达较单独感染组提前24h,ALV-J的蛋白表达较单独感染组增强,从蛋白层面证明了ALV-J和REV具有协同感染作用。为研究ALV-J和REV共感染细胞分泌的exosome在免疫抑制上是否也具有协同作用,我们无菌分离42日龄SPF鸡脾白细胞,加入定量的Exosomes共同培养一定时间,通过流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞数量,ELISA实验检测IL-2、IL-10、IL-12的分泌情况。结果显示,12h之前,Exo-RJ组CD4+和CD8+T细胞的数量均低于对照组;IL-2的分泌量在4h,Exo-RJ组高于对照组,且与Exo-R组差异显著;IL-10的分泌量在8h,Exo-RJ均显著低于对照组;IL-12的分泌量在0.5h,Exo-RJ均低于对照组,且差异显著。这说明共感染ALV-J和REV细胞分泌的exosomes对免疫细胞抑制作用增强。为揭示ALV-J和REV是否共同利用细胞信号通路达到协同作用,我们对提取到的exosome进行i TRAQ蛋白质组学分析,同时用相同的exosome样品提取RNA进行Hiseq mi RNA分析。结果显示,在CEF细胞培养上清液提取的exosome中共鉴定了1154种蛋白质,932种已知mi RNA和785种未知mi RNA。四组exosomes中均存在exosome的标志性蛋白质,如Hsp70、Hsp90、四跨膜蛋白、14-3-3等,而且我们exosome中检测到了ALV-J的gag、env蛋白质以及REV的gag、pol和env蛋白质,这说明病毒感染细胞分泌的exosome中携带了病毒结构蛋白。通过对表达差异蛋白的靶标蛋白、差异mi RNA靶标蛋白的聚类及信号通路分析,发现差异蛋白NCKAP1与差异mi RNA靶蛋白ITGA1位于共同的肌动蛋白细胞骨架(Regulation of actin cytoskeleton)信号通路上,使ARP2/3蛋白下调,抑制肌动蛋白聚合及板状伪足形成,说明ALV-J和REV从蛋白质水平和mi RNA水平共同启动了肌动蛋白细胞骨架通路,从而形成协同作用。肌动蛋白细胞骨架,是纤维状肌动蛋白在细胞中的分布网络,它具有维持细胞形状、调控细胞粘连及细胞运动等功能。实验证明该通路的异常改变会引起包括肿瘤在内的多种疾病的发生,并且有许多癌症的预防、治疗药物是通过改变肌动蛋白细胞骨架结构来实现的。我们对ALV-J和REV协同启动肌动蛋白细胞骨架通路的发现,不仅对研究ALV-J与REV协同机制意义重大,更将为禽肿瘤病或其它禽病研究提供科学的理论依据,为预防和治疗禽肿瘤病提供新的思路,但对这一通路还有待于进一步验证。