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1.研究目的研究补阳还五汤预处理对急性脑缺血再灌注损伤大鼠血小板活化作用及对血小板蛋白AktSer473、AktThr308、PDK1的影响,初步探讨补阳还五汤抗血小板活化作用与PI3K/Akt信号通路的联系。2.研究方法将84只雄性SD大鼠随机分为7组,分别为补阳还五汤A、B、C组(29.69,14.84,7.42 g/kg),硫酸氢氯吡格雷组(7.81×10-3g/kg),脑梗塞模型组,假手术对照组,空白对照组。各用药组大鼠分别给予相应剂量药物连续灌胃给药14天,其余组予等量蒸馏水灌胃。14天后补阳还五汤各组,硫酸氢氯吡格雷组,模型组采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)再灌注损伤模型,假手术组仅结扎单侧颈总动脉。缺血2 h再灌注6 h后根据大鼠行为学表现进行神经功能缺损评分,然后处死大鼠提取相应标本用于后续检测。3.研究内容3.1大鼠清醒后,参照Zea-Longa的五级四分评分法进行神经功能缺损评分。3.2处死大鼠提取脑组织均匀切成每2 mm一片,用2%氯化三苯基四氮唑(TTC)染色后用4%多聚甲醛固定24 h。用数码相机拍取照片后,使用Image-Pro plus图像分析软件处理,计算大鼠脑梗死面积百分比。大鼠脑梗死面积百分比=各切面梗死面积之和/各切面面积之和X 100%。3.3应用ELISA检测血浆中sCD40L水平,流式细胞术(FCM)测定全血中血小板活化标志物CD62P的表达变化情况,探讨补阳还五汤抑制血小板活化的作用。3.4采用蛋白免疫印迹法(Western Bloting)半定量检测富血小板血浆中PI3K/Akt血小板活化通路中AktSer473、AktThr308、PDK1等关键蛋白表达的变化。4.研究结果4.1与假手术组及空白组比较,模型组神经功能缺损评分及脑梗死面积比明显升高(P<0.01);与模型组比较,补阳还五汤各组及硫酸氢氯吡格雷组神经功能缺损评分及脑梗死面积比明显降低(P<0.05)。4.2空白组血浆中sCD40L及血小板CD62P明显低于其他各组(P<0.05或P<0.01);与假手术组比较,模型组sCD40L及CD62P明显升高(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,补阳还五汤各组及硫酸氢氯吡格雷组均明显降低血浆sCD40L及血小板CD62P的表达(P<0.05或P<0.01)。4.3与假手术组比较,模型组AktSer473、AktThr308、PDK1蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01),而补阳还五汤各组及硫酸氢氯吡格雷组Akt Ser473、AktThr308、PDK1蛋白磷酸化水平明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)。4.4补阳还五汤A、B、C(29.69,14.84,7.42 g/kg)不同浓度组对急性脑缺血再灌注大鼠的抗血小板活化及调控PI3K/Akt通路关键蛋白的作用均未呈现明显的量效关系(P>0.05)。5.结论5.1补阳还五汤预处理明显减轻急性脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损行为表现,并能降低脑梗死面积,具有明确的脑保护作用。5.2补阳还五汤可降低急性脑缺血再灌注损伤大鼠血浆sCD40L及血小板CD62P含量,具有明显的抗血小板活化作用。5.3补阳还五汤可降低急性脑缺血再灌注损伤大鼠血小板Akt Ser473、Akt Thr308、PDK1蛋白磷酸化水平,提示补阳还五汤可能通过抑制PI3K/Akt信号通路从而发挥抗血小板活化作用。