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猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)属于冠状病毒科β冠状病毒属成员,主要引起3周龄以下的仔猪产生神经功能紊乱、呕吐、腹泻等临床症状。PHEV具有典型的嗜神经特性,但该病毒致神经损伤机制尚不明确。Micro RNA(mi RNA)通过特异性地调控靶基因表达参与多种病毒的感染及致病过程已被广泛证实。本课题组前期通过基因芯片技术对PHEV感染小鼠脑组织进行检测,发现mi R-142a-3p等mi RNA表达量均有显著变化。本研究选取差异表达显著的mi R-142a-3p作为研究对象,通过靶基因的筛选、鉴定以及功能研究,初步揭示mi R-142a-3p在PHEV复制中的作用机制,为后续探究PHEV致病机理提供理论依据。本研究利用荧光定量PCR(q RT-PCR)方法检测PHEV体内外感染模型中mi R-142a-3p的表达量变化。结果显示,与对照组相比,mi R-142a-3p在病毒感染后表达量显著上调,与实验室前期基因芯片研究结果一致,推测其可能参与PHEV感染宿主的过程。随后,在N2a细胞中转染化学合成的mi R-142a-3p模拟体(mimic)并接种病毒,利用q RT-PCR和免疫印迹杂交技术(WB)检测细胞内PHEV m RNA和N蛋白的表达量。结果显示,转染mi R-142a-3p mimic的细胞中,PHEV m RNA和N蛋白表达量与对照组相比均出现显著的上调趋势。上述实验证实mi R-142a-3p参与PHEV感染宿主过程,并对病毒基因组复制起促进作用。为进一步明确mi R-142a-3p参与PHEV复制的机制,本研究运用Target Scan、mi RBase、Pic Tar等生物信息学网站对mi R-142a-3p的靶基因进行预测和筛选,最终选取与囊泡运输相关的Rab3a蛋白作为潜在靶基因进行后续研究。为了检测Rab3a是否为mi R-142a-3p特异性靶基因,分别构建了包含Rab3a 3′UTR靶位点的Rab3a-WT(野生型)和靶位点碱基被定点突变的Rab3a-MUT(突变型)双荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告检测系统结果显示,mi R-142a-3p可以与Rab3a3′UTR区域靶向结合。随后,在N2a细胞中转染不同剂量的mi R-142a-3p mimic或inhibitor,经q RT-PCR和WB检测发现,mi R-142a-3p呈剂量依赖性负向调控Rab3a表达水平。此外,间接免疫荧光(IFA)检测结果也为Rab3a是mi R-142a-3p的靶基因提供了进一步佐证,但mi R-142a-3p是否通过Rab3a影响PHEV复制还需进一步验证。为验证Rab3a是mi R-142a-3p调控PHEV复制的一个重要蛋白,本实验分别构建了特异性的Rab3a si RNA和过表达载体Rab3a-GFP。随后分别将si RNA或Rab3a-GFP转染至N2a细胞中,并接种PHEV。经q RT-PCR和WB检测表明,N2a细胞转染Rab3a si RNA后,PHEV m RNA和N蛋白的表达量均出现显著上调,而转染Rab3a过表达载体后,病毒表达量显著受到抑制。该实验结果不仅表明Rab3a对PHEV复制起到负向调控作用,也进一步证实了mi R-142a-3p可以通过调控Rab3a表达来影响PHEV复制。综上所述,在PHEV感染小鼠后,小鼠体内mi R-142a-3p表达量显著上调,进而靶向抑制Rab3a的表达,该过程显著促进了小鼠体内PHEV基因组复制。本研究成果不仅为mi RNA参与调控PHEV复制过程提供实验支持,也为深入探讨PHEV致病机理及治疗方案提供理论基础,具有重要的科学意义。