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细菌多药耐药外排泵是细菌产生固有性或者获得性耐药的一种重要机制。耐药节结化细胞分化（Resistance Nodulation-cell Division,RND）超家族是目前研究较多的外排泵,可介导阳离子、阴离子、重金属离子、芳香族氨基酸和去污剂的转运。目前RND超家族中研究比较清楚的是Acr AB外排泵系统,其蛋白晶体结构、功能、作用底物等已有广泛报道。RND超家族的另一成员Oqx AB外排泵系统可导致细菌对喹乙醇、喹诺酮、β-内酰胺等药物产生耐药,不仅影响兽医临床的防治效果,也对人类健康和公共安全形成潜在威胁。编码Oqx AB的基因oqx AB位于质粒上,其在动物源或人源菌株中的流行性与分布已有较广泛的研究,但关于Oqx AB结构-功能关系的研究则比较少。作为该系统中与底物转运密切相关的内膜转运蛋白,Oqx B在底物结合和选择方面都发挥着重要作用,明确其关键结构和转运功能的关系,可帮助我们更深入地了解多药耐药的内在机制,阐明细菌对不同药物的转运规律,为动物养殖业的药物耐药性防治提供基础数据,对指导临床合理用药和开发新药物具有积极的理论和实践意义。本论文利用生物信息学工具、点突变和抗菌敏感性等实验,探索Oqx B蛋白中对转运功能起关键作用的氨基酸,获得的主要研究结果如下:（1）从野生大肠杆菌菌株LDHF174克隆获得oqx AB基因,将其转入工程菌BL21后,成功表达重组Oqx A和Oqx B蛋白,将该菌株命名为BL21-Oqx AB菌株。通过抗菌敏感性实验,发现BL21-Oqx AB菌株对喹乙醇和环丙沙星的MIC值比转入了空载体的对照菌株提高4倍。为更好地研究该外排泵系统的功能,我们建立了直接测定细菌外排环丙沙星的方法,底物动力学分析表明,Oqx AB系统转运环丙沙星的Km值为1.94±0.37μM,Vmax为0.12±0.01 nmol/mg protein/min。对不同种类抗生素药物的检测表明,除喹乙醇和环丙沙星（氟喹诺酮类）外,BL21-Oqx AB菌株对头孢噻呋（β-内酰胺类）和四环素（四环素类）的MIC值比对照菌株提高了4倍,对氟苯尼考（酰胺醇类）的MIC值比对照菌株提高了8倍,但是对左氧氟沙星（氟喹诺酮类）、诺氟沙星（氟喹诺酮类）、利福平（利福霉素）、硫氰酸红霉素（大环内酯类）和三氯生这些药物不产生耐药。此外,RND外排泵常用的抑制剂苯丙氨酸精氨酸β萘胺（Phenylalanine arginine beta naphthylamide,PAβN）及1-（1-萘甲基）-哌嗪（1-（1-naphthylmethyl）-piperazine,NMP）可显著降低BL21-Oqx AB菌株对喹乙醇的MIC值,且抑制效果具有浓度依赖关系,抑制剂浓度越高抑制效果越明显。NMP和PaβN对其他BL21-Oqx AB菌株产生抗性的药物,包括环丙沙星、四环素、头孢噻呋和氟苯尼考等,也有显著的抑制作用,说明BL21-Oqx AB菌株对这些药物的转运确实与RND外排泵系统Oqx AB有关。（2）通过SDS-PAGE分别纯化大肠杆菌重组表达的Oqx A与Oqx B蛋白,免疫兔子制备了Oqx A与Oqx B的多克隆抗体。用制备的多克隆抗体对野生型菌株LDHF174进行Western blotting实验发现,在Oqx A和Oqx B目标蛋白位置可检测到特异蛋白杂交条带,表明该多克隆抗体与Oqx A和Oqx B结合具有特异性。通过免疫荧光的方法对BL21-Oqx AB菌株的蛋白表达及定位进行检测发现,在BL21-Oqx AB中可分别检测到Oqx A和Oqx B蛋白的荧光标记信号,且该信号主要分布于细胞膜。进一步利用超速离心分离获得BL21-Oqx AB菌株的膜组分,Western blotting的分析也同样获得了特异性的Oqx B蛋白条带。这些结果表明Oqx A与Oqx B在BL21-Oqx AB菌株中可表达在其发挥作用的正确位置。（3）我们通过在线TMHMM和TOP2软件进行蛋白拓扑异构分析,预测Oqx B含有12个跨膜区（Transmembrane domains,TMs）。序列同源性比对结果表明,RND超家族中与质子传输相关的氨基酸高度保守,Oqx B蛋白位于TM4的D410、D411,TM10上的K946和位于TM11的R976可能与质子传递相关。RND超家族氨基酸序列同源性分析也预测了Oqx B上的V141、F180、Y330、F636和F626可能是与药物结合的关键氨基酸。以Acr B已报道的结构（PDB ID:1IWG）为模板对Oqx B进行同源建模,结合Auto Dock Vina分子对接分析表明:Y330与喹乙醇和环丙沙星均有相互作用,V141和F626参与与喹乙醇的互作,而F180只参与环丙沙星与Oqx B的相互作用。（4）我们通过点突变方法,将Oqx B与质子传输相关的D410、D411和R976突变为丙氨酸,发现突变体完全丧失了转运药物的功能;但是K946突变为丙氨酸后对药物的转运无显著影响。另一方面,将D410、D411和R976突变为带相同电荷性质的保守氨基酸后,突变体对药物的转运功能得到部分或全部的恢复,表明D410和D411上的负电荷以及R976上的正电荷对Oqx B的转运功能起重要作用。（5）对可能参与药物结合的关键氨基酸V141、F180、Y330、F636和F626,我们通过点突变与外排泵功能实验研究,发现不同的氨基酸可能负责不同底物的识别和相互作用。突变体V141A丧失了对喹乙醇和氟苯尼考的耐药功能;Y330A丧失了对喹乙醇、环丙沙星和氟苯尼考的耐药功能;F626A丧失了对喹乙醇、头孢噻呋和氟苯尼考的耐药性;F180A则维持了除环丙沙星以外的所有测试药物的转运功能;突变体F636A仍维持对所有测试药物的转运能力。将Y330、F180和F626突变为保守的带苯环结构的氨基酸后,突变体对各类抗生素的转运功能得到部分或全部的恢复,表明苯环结构在这些底物的转运过程中起着重要的作用,可能是通过π-π键与底物发生了相互作用;但是对V141的保守突变无法恢复转运蛋白对喹乙醇和氟苯尼考的转运能力。我们的研究结果表明,Oqx B蛋白位于质子通道上的D410、D411和R976所带的电荷对其转运功能有重要作用。此外,位于底物结合区域的不同关键氨基酸决定了不同药物的识别与转运,而这些氨基酸中所带的苯环可能是其参与转运或识别过程的关键结构。本文取得的结果,为更好地阐述Oqx B外排转运蛋白的结构-功能关系,从分子水平上深入了解Oqx B对不同药物的转运机制提供了理论基础。