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植物瞬时表达系统是指外源基因转染植物后,与宿主细胞染色体DNA不发生整合,但外源基因在宿主细胞中短期而快速表达,产生瞬时效应。瞬时表达系统在研究基因产物的亚细胞定位、蛋白互作、启动子活性等方面具有重要作用。另外,瞬时表达系统操作简单无需特殊仪器设备、外源基因的表达效率高、安全,不易产生基因漂移,可有效避免基因沉默等,在基因功能研究、转基因工程中应用广泛。启动子是与转录起始复合物及多种转录因子相互作用的一段DNA序列,控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度。根据不同的转录模式,启动子分为3类:组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子驱动基因在植物不同时间和空间范围内均能表达;组织特异性启动子驱动下的基因在某个组织部位特异性表达;诱导型启动子在各种环境胁迫条件下可诱导基因大量表达,而在正常情况下基因不表达或表达量很低。本实验中,我们利用棉花子叶为实验材料,建立了以eGFP为报告基因的棉花子叶瞬时表达系统。以本实验室确定的长为247 bp的D-7序列为基础,构建了具有不同干旱元件的系列棉花诱导型启动子和添加了 28 bp SynJ(人工合成的1个增强子序列)的启动子,以及棉花干旱胁迫响应蛋白1基因(DREBl)启动子,利用棉花子叶瞬时表达系统分析了上述启动子活性及其诱导特异性。在此基础上,将上述各类含eGFP标记的启动子转入拟南芥中,进一步分析各类启动子活性及瞬时表达系统的可信度。实验取得结果如下:1.本实验以棉花子叶为材料,利用农杆菌注射法建立了 eGFP为标记基因的瞬时表达系统,确定了子叶的最佳生长时期,注射菌量,共培养时间等,结果表明利用萌发6天的棉花子叶注射50 μL OD600为0.5的含目的基因的农杆菌LBA4404,共培养3天后,eGFP表达效率最高。2.构建了DREB 启动子,系列人工合成的D-7干旱启动子及添加了 28 bp SynJ的启动子与eGFP融合载体,命名为:pDREBl-eGFP、pDrought 1、pDrought 3、pDrought5、pDrought7、p28nt-eGFP。利用建立的棉花子叶瞬时表达系统检测eGFP表达量,分析启动子活性,干旱诱导显示pDREBl-eGFP、pDrought 1、pDrought 3、pDrotught 5、pDrought 7载体对干旱有响应,可能为诱导型启动子,而p28nt-eGFP,为强的适合在棉花中表达的组成型启动子。3.将 pDREBl-eGFP、pDrought 1、pDrought 3、pDrought 5、pDrought7 载体通过农杆菌GV3101转化拟南芥,采集拟南芥不同组织检测eGFP表达量,分析启动子活性,干旱胁迫发现各载体对干旱有响应。4.利用转基因拟南芥表达分析各类诱导型启动子的结果与棉花子叶的瞬时表达系统分析的结果有一致性,说明以eGFP为标记基因的棉花子叶瞬时表达系统可以成功应用于启动子的研究。但是,改造后的启动子活性仍然较弱,因此,在后续实验中可考虑在启动子上游区添加其他侧翼序列,将D-7启动子改造成为一个强的诱导型启动子。