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内皮素（endothelin，ET）是一类作用强烈的缩血管肽，主要分布于心血管系统，其生物效应由ETA及ETB两种受体介导。ET家族中ET-1的缩血管作用最强，并具有增加心肌收缩力、促心肌细胞肥大等广泛的心血管效应。ET-1与心肌缺血／缺氧关系密切，缺血／缺氧可强烈刺激ET-1表达。已有报道外源性ET-1具有致心律失常的作用，ETA受体拮抗剂可减少心肌梗塞面积，改善心功能，减少缺血再灌注后心律失常的发生，但对急性缺血性心律失常的观察甚少。10-23脱氧核酶由单链DNA组成，具有稳定的空间结构，可反复切割特定RNA，从而阻断特定基因表达。本工作用体外转录的ET-1全长RNA作为底物，设计ET-1 10-23脱氧核酶，在体外筛选能切割ET-1 RNA的10-23脱氧核酶，将筛选有效的ET-1 10-23脱氧核酶转染心肌细胞，在细胞水平筛选具有生物学效应的ET-1 10-23脱氧核酶；观察ET-1 10-23脱氧核酶对模拟低氧的培养心肌细胞的保护作用；观察ET-1 10-23脱氧核酶对离体灌流的大鼠心脏结扎左冠状动脉前降支（LAD）后60min内急性心律失常的发生和心功能的影响，以进一步明确内源性ET-1在急性缺血性心律失常发生中的作用，为急性缺血性心律失常的防治及ET-1过量表达所致有关疾病提供理论和实验依据。本实验中方差齐性的多组数据采用方差分析，方差不齐的数据则采用秩和检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。 方法和结果： 1．ET-1 10-23脱氧核酶的设计与体外筛选 （1） 本工作设计的ET-1 10-23脱氧核酶含有15个核苷酸的催化核心及9个核苷酸的底物结合区，其5’及3’端各有两个核苷酸硫代修饰。切割位点为大鼠ET-1 mRNA起始位点AUG起至下游+219核苷酸之间所有AU及GU连接，选出5条与底物结合熵值＜-24kcal／mol的脱氧核酶，根据切割位点前后分别命名为DZ1～DZ5。 （2） 抽提正常雄性SD大鼠心脏组织总RNA，逆转录后PCR扩增ET-1全长cDNA，体外转录32p标记的RNA，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化RNA底物，放射博士学位论文内皮素一1 10一23脱载核醉的构建及其杭急性缺血性心律失常的实脸研究自显影鉴定，得到长度均一的ET- 1 RNA，电洗脱回收后，用于体外切割试验。（3）5脚moULET一1 RNA底物与1脚。比10一23脱氧核酶37℃孵育lh，变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离放射自显影成像，观察到DZZ、DZ3、Dz4及DZS均可切割ET一1 RNA底物，仅Dzl对底物无切割作用，其中切割位点位于G147u的Dz4，其两侧结合区结合自由能之差最大，lh切割率最高，达83.5%，DZ3两侧结合区结合自由能之差最小，其切割效率亦最低，而DZZ和DZS虽两侧结合区结合自由能之差相等，但DZZ总的结合自由能低于DZS，其切割效率高于DZS。2.DZ4对心肌细胞ET一1基因表达及细胞肥大的影响（1）原代培养乳鼠心肌细胞对5’端标记荧光素队M的DZ4的摄取用脂质体转染标记的Dz4（0.2娜。比）1 Zh后，心肌细胞内无荧光出现，24h后胞核中荧光较强;采用磷酸钙沉淀转染标记的Dz4的心肌细胞12h后有荧光出现，24h增强，荧光较脂质体转染强。激光共聚焦显徽镜结果显示，磷酸钙沉淀转染心肌细胞24h后，细胞胞浆及细胞核中有荧光分布。（2）脂质体转染心肌细胞24h后，半定量RT一PCR结果显示，血清对照组ET一l/p一actin条带光密度积分值为0，615土0.044，脂质体对照组为0.617士0.050;0.1脚ol几DZ4组ET一1/p一actin条带光密度值之比为0.56肚0‘046，与血清对照组及相应脂质体对照组比较无显著差异（n=5，P>0.05）;0.2脚ol几Dz4组ET一1/p一actin条带光密度值之比为0.471士0.053，较血清对照组及相应脂质体对照组明显降低（n=5，p<0.05）。血清对照组与两个脂质体对照组之间，ET一1/p一actin无统计学意义。实时荧光定量PCR结果显示，脂质体转染心肌细胞24h后，o，1卿ol几Dz4组ET一1 mRNA表达量与血清对照组之间无显著差异（n二3，P>0.05）;0.2脚叮0比Dz4组ET一1 mRNA表达量降至血清对照组的6肚10%（n=3，P<0.05）。磷酸钙沉淀转染心肌细胞24h后，实时荧光定t PCR结果显示血清诱导组ET-1 mRNA增高至非诱导组的12妊11%（n==3，P<o.05），0.1脚ol/L Dz4组ET- lmRNA含t降低至非诱导组的94月0%（n=3，p<0.05），明显低于血清诱导组（二3，p<o，05）。0.2脚叮O比Dz4组降低至非诱导组的6肚6%（n=3，p<0.05），显著低于非诱导对照组、血清诱导组及0.1脚。比DZ4组（二3，p<0.05）。反相结合序列对照组0.2林mo比rDz4转染24h后，ET一1 mRNA表达量与血清诱导组相比无显著差异（n=3，护。，05）。博士学位论文内皮素一1 10一23脱氧核踌的构建及共杭息性缺血性心律失常的实脸研究（3）血清诱导肥大心肌细胞经脂质体转染Dz4 24h后，0.2卿。比Dz4组的细胞活力与脂质体对照组比较细胞活力降低27%（n=8，p<0 .05），细胞总蛋白下降33%（n=5，p<0 .05），蛋白质合成速率下降34%（n=5，p<0.05），0.1林m01几DZ4组改变不明显。磷酸钙沉淀转染24h后，血清诱导组与非诱导组相比细胞活力改变不明显，细胞总蛋白增加39%（n=5，p<0.05），蛋白质合成速率增加45%（n二5，p<0 .05）:0.1脚mo比Dz4组的细胞活力与血清诱导组相比细胞活力改变不明显，细胞总蛋白下降29o/ofn=5，p<0 .0