抗原特异性T淋巴细胞(Antigen-Specific T cell, AST)是介导适应性免疫应答的核心细胞,在抗感染、抗肿瘤、超敏反应、自身免疫病以及移植排斥中都起着至关重要的作用,其数量的多寡和功能的强弱能直接反映人体特异性细胞免疫的功能状态。但是,与特异性抗体的检测相比,抗原特异性T细胞的数量和功能检测都困难许多,方法少而复杂。目前pMHC多聚体荧光染色加流式细胞分析技术是抗原特异性T细胞数量检测的金标准。但由于多聚体制备技术复杂,商品化产品种类少,且昂贵,不呈系列,限制了其广泛应用。针对抗原特异性T细胞数量和功能的检测,无论是普遍应用的酶联免疫斑点法或细胞内细胞因子染色法,还是pMHC多聚体流式染色法以及新近出现的pMHC芯片法和人工抗原提呈细胞芯片技术等,各有其优势和缺陷,每种方法单独应用于T细胞的检测都不能简单快速地同步进行细胞数量和功能的分析。因此创建一种简单易行、可同步对抗原特异性T细胞进行数量和反应活性检测的新方法成为一个新的探索方向。为此,本研究利用商品化的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体作为靶向抗原,包被在直径4.5微米的磁珠表面制成磁珠式人工抗原提呈细胞(aAPC-beads),以OT-1转基因鼠脾淋巴细胞群中的OVA抗原特异性T细胞作为待检的靶细胞,建立了磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板技术(aAPC-microplate),优化了实验方案,并着重进行了方法学论证。该技术的基本方案是：将aAPC-beads与OT-1鼠脾淋巴细胞以1：1的比例接种在已包被有抗IFN-γ抗体的透明酶联免疫斑点微孔板(ELISPOT板)中共孵育2小时,然后在96孔板式磁场的作用下分选与磁珠结合的OVA抗原特异性T细胞,光镜下计数分选所得细胞数,计算其占接种的淋巴细胞数的比例；继而在分选孔中加入抗原性刺激物,置细胞培养箱中继续培养24小时,激发OVA抗原特异性T细胞活化并分泌细胞因子,最后用ELSIPOT技术检测分泌IFN-γ的细胞,计数斑点数,计算分选所得细胞群中有反应活性的细胞比例。另外,由于商业化二聚体H-2Kb-Ig/dimer价格昂贵,且我们后续实验必须用自制的多聚体进行方法学论证,故我们用OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα链胞外区以及Avi标签和His6标签重组成单链融合基因,构建重组质粒,进而进行表达、提取和纯化制备SCT复合物。本论文的主要结果如下：1、aAPC-microplate优化方案(CD8-T细胞预分选)检测OVA抗原特异性T细胞的数量时,每个待检细胞样品设5.个检测数量组,海个细胞数量组设置3个复孔,.每个数量组的阳性细胞数由复孔的平均值表示,最终的阳性细胞比例由5个检测数量组的直线回归方程校正得出。方法学的准确性分析显示：磁珠分选所得细胞数与接种的淋巴细胞数之间呈现了良好的数量依赖关系和线性关系,R2值达到0.99以上。5只OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA抗原特异性T细胞的比例分别为11.27%、9：40%、12.62%、14.77%和21.85%；经典的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体荧光染色及流式分析结果分别为13.69%、10.13%、16.88%、16.77%和21.45%。两组数据问无统计学差异,相关系数为0：9280；PE-anti-mouse TCR Vα2荧光染色及流式分析结果分别为15.94%、18.23%、32.08%、31.29%和42.88%,明显高于H-2Kb-Ig/OVA257-264 二聚体荧光染色结果和aAPC-microplate检测法结果,差异显著(p<0.05),相关系数分别为0.85-0和-8054。特异性分析显示：用无关抗原肽的Kb/TRP2-beads同步分选OT-1鼠脾淋巴细胞群时,阳性细胞比例则降为0.45%左右；经Kb/OVA-beads磁珠分选后所得细胞群中的OVA抗原特异性T细胞比例经H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体荧光染色及流式分析为84.48%和89.80%(两次实验结果),而分选前的比例为13.69%和10.13%。重复性分析显示：在5个检测数量组之间,阳性细胞比例的平均批内CV值为4.4%；对同一份OT-1鼠脾淋巴细胞群进行三次重复实验时,批间CV值为13.5%,阳性细胞比例分别为9.40%、9.77%和9.47%；R2值分别为0.9959、0.9970和0.9960。上述结果显示aAPC-microplate优化方案具有较高韵特异性、准确性和重复性以及与传统检测方法的相关性,提示了该技术检测抗原特异性T细胞数量的可行性。2、aAPC-microplate优化方案同步检测OVA抗原特异性T细胞的数量和反应活性时,经过磁珠分选和计数后,两只OT-1鼠脾淋巴细胞群中OVA特异性T细胞比例为12.62%和21.85%,与经典的pMHC二聚体荧光染色法的结果(16.88%和21.45%)相近。在3种不同形式和性质的刺激物中,PHA刺激OVA抗原特异性T细胞活化并分泌IFN-y的能力最强,反应活性比达59.91-63.99%；其它两种刺激剂(磁珠式aAPC-beads,游离的OVA多肽+anti-CD28)的刺激能力次之,反应活性比在45.14-54.35%,且相互间差异不显著。这提示了aAPC-microplate技术在评价抗原特异性T细胞活性功能方面的可行性。3、通过PCR技术将两个寡核苷酸接头(Linker)与OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα链胞外区以及Avi标签和His6标签重组成单链融合基因,成功构建了重组质粒,在BL21菌中表达、提取和纯化了H-2Kb/OVA单链三聚体包涵体蛋白(SCT),并在体外通过稀释复性法折叠成H-2Kb/OVA SCT复合单体,通过生物素-亲和素系统制备了PE标记的H-2Kb/OVA SCT四聚体。将H-2Kb/OVA SCT复合单体包被细胞大小的磁珠后用H-2Kb分子构象特异性单抗进行荧光染色和流式分析,验证了折叠后的H-2Kb/OVA SCT复合单体在磁珠表面具有正确的空间构象和定向；利用PE-H-2Kb/OVA SCT四聚体对OT-1鼠脾淋巴细胞进行荧光染色和流式分析,检测OVA抗原特异性T细胞的比例(19.90%),并与商品化的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚体荧光染色结果(21.85%)相比较,初步验证了H-2Kb/OVA SCT复合体与特异性TCR的结合能力。这些结果为下一步利用自制pMHC多聚体对aAPC-microplate技术重新进行方法学验证奠定了基础。