[背景和目的]肠屏障功能是指防止肠腔内有害物质如病原体和毒素穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环的结构和功能的总和,同时其可以选择性的吸收营养物质。该屏障遭到破坏可导致严重的病理后果,甚至导致死亡。获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的、以外周血CD4+T细胞下降导致的免疫缺陷为主的慢性消耗性传染病。现有研究证实,由于肠道的解剖位置和组织结构,使其成为HIV攻击的主要靶器官,也是病毒的主要贮存场所。在HIV感染早期肠道的CD4+T细胞就大量耗竭,肠道粘膜免疫受损,肠粘膜屏障通透性增加,导致微生物和免疫刺激性代谢产物首先从固有层中的肠腔通过,然后在体循环中通过,从而持续促进局部和全身炎症反应。有研究表明,若HIV感染者早期未发生微生物移位,则将不会进展为AIDS,可以说,肠道微生物移位是HIV感染进展为AIDS的关键。因此,肠屏障损伤的机理研究,找到肠屏障损伤后修复的生物标志物,对改善患者预后及延缓、甚至阻断病程发展意义重大。miRNA在HIV感染者肠道中的变化对患者的肠道病变起主要作用,某些miRNA通过靶基因调节肠上皮细胞膜渗透率与病毒增殖,可能涉及炎症、过氧化和细胞凋亡等机制。HIV早期感染者肠道中,miRNA的表达情况不同可能是导致肠病的关键因素。但miRNA-mRNA的相互作用如何影响肠上皮细胞及其屏障功能尚不清楚。我们的前期工作对AIDS患者肠黏膜基因组表达(包括miRNA和mRNA)进行了筛查和信号通路分析,获得了关键通路(如紧密连接相关通路和细胞黏附等)中可能起重要作用的靶标基因——PLCβ1及其下游的ZO-1基因,并通过生物信息学预测miR-1297可能是调控PLCβ1及其下游通路的重要因子。miR-1297在消化道的功能已有普遍研究,但miR-1297是否是调控肠黏膜损伤细胞模型生长、迁移的重要分子尚待验证。上皮修复机制会迅速重建连续的上皮单层细胞以防止细菌、毒素及病毒的吸收,降低病原体及其毒素侵入粘膜的能力。细胞质斑块与膜蛋白结合组成负责调节细胞旁通透性的紧密连接,鸟苷酸激酶(MAGUK)超家族的蛋白质ZO-1构成了细胞质斑块的主要成分,在粘膜修复过程中结合肌动蛋白重排细胞骨架。因此,PLCβ1及其下游的ZO-1基因表达都与损伤肠粘膜的修复密切相关。用革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理人结肠上皮细胞株可以模拟体内肠上皮细胞受损、肠粘膜遭受炎症侵袭等过程。本实验构建了 LPS损伤人结肠上皮细胞模型,以关键基因PLCβ1及可能的上游调控因子miR-1297为研究中心,探讨这两个分子在LPS诱导的肠屏障损伤修复过程中的变化规律,初步探索与HIV/AIDS早期肠黏膜损伤相关的重要靶标,将为更好地理解、阐明AIDS患者肠黏膜损伤修复过程提供理论基础。[方法]建立LPS损伤肠上皮细胞模型,构建miR-1297过表达和干扰慢病毒体系,转染LPS损伤的CCC-HIE-2细胞,通过RT-qPCR实验检测miR-1297在细胞内表达情况;Western blot实验检测miR-1297对靶基因PLCβ1在细胞模型中表达的影响。构建PLCβ1过表达和干扰慢病毒体系,再利用Western blot和细胞双荧光实验检测PLCβ1下游紧密连接蛋白ZO-1表达情况;MTT及荧光黄检测细胞活力及渗透性,观察过表达或干扰PLCβ1及过表达和干扰miR-1297对LPS损伤的CCC-HIE-2细胞生物学功能的影响。细胞高通量测序用于分析细胞模型中过表达PLCβ1和敲除miR-1297对转录组的影响,生物信息学鉴定过表达PLCβ1及敲除miR-1297后的差异基因及其基因功能注释,探究差异基因在胞内可能参与的信号通路,用于后续验证研究。[结果]1.miR-1297过表达下调PLCβ1蛋白表达,miR-1297抑制上调PLCβ1蛋白表达,证明miR-1297对PLCβ1为负向调节作用。2.抑制miR-1297使LPS损伤的CCC-HIE-2细胞活力增强,说明抑制miR-1297对LPS损伤的肠黏膜上皮细胞生长有促进作用。过表达PLCβ1基因后的LPS损伤CCC-HIE-2细胞活力实验表明,过表达PLCβ1能增强细胞活力。3.miR-1297ib转染过表达PLCβ1基因的LPS损伤CCC-HIE-2细胞,western blot和细胞荧光定位实验均表明,抑制miR-1297的表达使PLCβ1的蛋白表达上调,下游ZO-1基因相继上调;过表达PLCβ1基因能上调ZO-1基因表达,二者的表达呈正相关关系。过表达miR-1297使PLCβ1的蛋白表达下调,相应地下调了 ZO-1蛋白的表达。4.抑制miR-1297表达降低了 LPS损伤CCC-HIE-2细胞的渗透性,过表达miR-1297增强了细胞的渗透性;过表达PLCβ1降低了 LPS损伤CCC-HIE-2细胞的渗透性,敲降PLCβ1能增加LPS损伤CCC-HIE-2细胞的渗透性。5.过表达PLCβ1的CCC-HIE-2细胞转录组测序结果显示转录组表达谱中,上调基因2908个,富集程度最高的生物学过程(Biological Process,BP)为:氧化还原过程(oxidation-reduction process);富集程度最高的细胞组分(Cellular component,CC)为:细胞质(Cytoplasm);上调基因中富集程度最高的分子功能(molecular function,MF)为:蛋白质结合(protein binding):上调 mRNAs富集的最显著的信号通路是:核糖体(Ribosome)。6.过表达PLCβ1的CCC-HIE-2细胞转录组测序结果显示转录组表达谱中,下调基因1645个,富集程度最高的生物学过程(Biological Process,BP)为:转录调控(regulation of transcription);富集程度最高的细胞组分(Cellular component,CC)为:细胞质(cytoplasm);下调基因中富集程度最高的分子功能(molecular function,MF)为:金属离子结合(metal ion binding);下调 mRNAs富集的最显著的信号通路是:TGF-β信号通路(TGF-beta signaling pathway)。7.敲除miR-1297的CCC-HIE-2细胞中,转录组测序结果显示显著差异上调基因181,富集程度最高的生物学过程(Biological Process,BP)为:尿素循环(urea cycle);富集程度最高的细胞组分(Cellular component,CC)为:线粒体基质(mitochondrial matrix);下调基因中,富集程度最高的分子功能(molecular function,MF)为:钙调素结合(calmodulin binding);下调mRNAs富集的最显著的信号通路是:精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)。8.敲除miR-1297的CCC-HIE-2细胞中,转录组测序结果显示显著差异下调基因2948个,富集程度最高的生物学过程(Biological Process,BP)为:嗅觉感知中化学刺激的检测(detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smell);富集程度最高的细胞组分(Cellular component,CC)为:角蛋白纤维(keratin filament);下调基因中,富集程度最高的分子功能(molecular function,MF)为:嗅觉受体活性(olfactory receptor activity);下调 mRNAs 富集的最显著的信号通路是:嗅觉转导(Olfactory transduction)。[结论]LPS损伤CCC-HIE-2模型中miR-1297负向调控PLCβ1,肠屏障损伤中PLCβ1下调是由于miR-1297过表达引起,并介导下游的紧密连接蛋白ZO-1下调,致使上皮细胞修复进程中细胞骨架重排受阻,模型细胞活力下降,渗透性增加,最终导致细胞凋亡。相应地,上调PLCβ1或下调miR-1297的表达,或能修复LPS造成的CCC-HIE-2细胞损伤,PLCβ1和miR-1297可能成为肠屏障损伤修复的重要靶点。