【摘 要】
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母猪早期妊娠诊断有利于缩短未孕母猪空怀期,提高母猪繁殖力和生产效益,因此寻找并开发一种新型妊娠生物标志物十分重要。外泌体（Exosome）是一种内含各类核酸蛋白脂质的一种胞外囊泡,可作为细胞交流的通讯因子。其中携带的micro RNA是一种内源性小分子非编码RNA,广泛存在于真核生物中并参与调控各类细胞进程。大量研究表明,外泌体及miRNA参与了胚胎生长发育、神经肌肉的增殖分化、性成熟及免疫应答等
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母猪早期妊娠诊断有利于缩短未孕母猪空怀期,提高母猪繁殖力和生产效益,因此寻找并开发一种新型妊娠生物标志物十分重要。外泌体（Exosome）是一种内含各类核酸蛋白脂质的一种胞外囊泡,可作为细胞交流的通讯因子。其中携带的micro RNA是一种内源性小分子非编码RNA,广泛存在于真核生物中并参与调控各类细胞进程。大量研究表明,外泌体及miRNA参与了胚胎生长发育、神经肌肉的增殖分化、性成熟及免疫应答等一系列生命活动,对哺乳动物妊娠早期胚胎发育及子宫内膜和子宫内环境发育变化等有重要调控作用。本论文研究了妊娠早期母猪血清外泌体miRNA差异表达情况及初步机理,探究外泌体miRNA在生产实践中作为诊断标志物的可能。也为解析妊娠早期胚胎和子宫的变化与机体循环体液的变化联系、妊娠早期miRNA在胚胎发育中的作用和改善母猪繁殖性能提供参考资料。本研究以发情期（假受精第9 d）、妊娠期（同步受精第9 d、12 d、15 d）的大白猪为研究对象,利用超速离心法分离了各时期母猪血清中的外泌体并用透射电镜分析、粒径分析、免疫印迹蛋白分析和纳米流式分析展现其相关特征。利用RNA-Seq分析miRNAs在各时期的表达谱,挑选差异表达miRNAs在扩增样本中通过RT-q PCR进一步验证,筛选出可靠的差异miRNAs作为妊娠早期标志物。然后对筛选出的miRNAs做靶基因预测,分析其生物学功能,结合miRNAs在各组织中的表达情况,探究其在妊娠早期的作用。具体研究结果如下:（1）通过超速离心法从母猪各时期中获得形态结构良好的外泌体,相对于用试剂盒分离外泌体的方法,超速离心法获得量更大、密度更纯的外泌体。同时,在妊娠早期分离获得的外泌体量无显著差异。（2）通过对妊娠早期母猪血清外泌体miRNA的建库测序获得较高评分的测序质量,在大量reads中含有包括miRNA的各种小RNA,在miRNA预测中也发现许多novel miRNA,这些小RNA和miRNA的变化可能与母猪妊娠早期机体和胚胎的发育调控有关。（3）通过测序展现出的miRNAs表达谱进行差异分析,以妊娠15天为基准共筛选出11个差异miRNAs,在独立群体中对这些差异miRNAs进一步使用RT-q PCR验证共筛选出ssc-miR-92b-3p和ssc-miR-17-5p两个miRNAs可作为早期妊娠诊断的生物标志物。（4）对所有miRNAs进行差异分析,并将所有测序结果显示出的差异miRNA进行靶基因预测及其功能解析发现其与多种生物学功能有关。ssc-miR-92b-3p和ssc-miR-17-5p两个显著差异表达的miRNA在妊娠早期的调控功能主要以作用于靶基因进行。主要靶向基因且在胚胎附植前期和繁殖力上起调控作用的有HAND1、HCRTR1、PFKM、BSG、ATF6B。综上所述,外泌体存在母猪血清中,妊娠期与发情期的外泌体差异主要体现在其内容物上,差异表达的miRNAs及其靶基因在妊娠早期有重要的调控作用,外泌体携带的miRNAs可作为早期妊娠的生物标志物。
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