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近年来随着对RNA分子研究的深入,具有调控功能的非编码小RNA分子(smallnon-codingRNAs,sRNAs)日益引起人们的重视。Hfq是细菌中相对保守的RNA结合蛋白,主要在转录后水平上全局调控细菌基因的表达。RsmB属于CsrB家族的小RNA,是翻译阻遏蛋白RsmA的拮抗剂。两者同属细菌转录后全局调控子,对于调节细菌生理、行为和环境适应性具有重要意义。
本研究以S.plymuthicaG3为模式细菌,一方面在已获得了hfq、rsmB基因突变体的基础上,结合抗逆性检测和比较蛋白质组学分析等方法,系统鉴定了Hfq和RsmB的功能;另一方面通过构建突变体、互补菌株和表型分析等策略,初步鉴定了G3菌株中2个群体感应(Quorumsensing,QS)系统N-乙酰基高丝氨酸内酯(N-aceylhomoserinelactone,AHL)信号合成酶编码基因splI、spsI调控的生防相关表型;进一步采用基于lux-或lacZ-报告基因融合的策略分析了Hfq和RsmB对splI、spsI基因表达的影响以及splI和spsI基因的相互调控。主要结论如下:
1.Hfq、RsmB的功能分析
(1)影响菌株G3抗逆性:当hfq、rsmB基因突变后,细菌在高温、酸性、碱性以及氧化环境条件下的存活率明显降低。
(2)基于G3/rsmB::lux和△hfq/rsmB::lux的转录融合分析发现,△hfq/rsmB::lux的生物发光明显低于G3/rsmB::lux,表明Hfq可影响rsmB基因的表达;同时基于G3/hfq::lacZ和△rsmB/hfq::lacZ的翻译融合分析发现,与野生菌G3相比,△rsmB/hfq::lacZ菌株的β-半乳糖甘酶活性处于较低的水平,表明RsmB也参与调控Hfq的翻译。另外,基于lux-或lacZ-的报告基因融合分析还显示两个全局转录后调控子RsmB和nfq之间存在相互调控作用。
2.基于基因替换、同源重组策略分别构建了G3菌株2个AHL信号分子合成酶基因splI和spsI的突变体和互补菌株。比较分析了野生菌G3与△splI、△spsI等衍生菌株的AHL信号分子、胞外酶和运动性等生防相关表型。结果表明SplI和SpsI正调控蛋白酶活性,差异调控泳动运动性:SplI负调控泳动运动性,而SpsI则正调控G3菌株的泳动运动性。另外,△splI、△spsI突变体对AHLs信号的产生无显著影响。
3.基于G3/spsI::lacZ、△rsmB/spsI::lacZ、△hfq/spsI::lacZ;G3/splI::lacZ、△rsmB/splI::lacZ、△hfq/splI::lacZ的翻译融合发现,nfq对SpsI、SplI翻译的影响不是很明显。相反,与野生菌相比,△rsmB/spsI::lacZ、△rsmB/splI::lacZ菌株的β-半乳糖甘酶活性处于很低的水平。