叶籽银杏叶生雌性生殖器官发育相关基因的克隆与序列分析

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银杏(Ginkgo biloba L.)系第四纪冰川之后惟一在中国保存下来的一孑遗种子植物。在其漫长的演化历程中,银杏的种子和叶片发生了明显的形态变异。1891年,Shirai在日本发现了世界上第一株叶籽银杏(Ginkgo biloba L. var. epiphylla Mak.)。作为银杏家族中的特异种质,叶籽银杏具有重要的观赏价值和科研价值。本实验室已对叶籽银杏的分类地位和系统发育进行了研究,然而对于叶籽银杏的发生机制还没有确切的定论。本研究以叶籽银杏和银杏为研究试材,对其LEAFY同源基因和GbMADS5基因进行了克隆、分析。主要研究结果如下:1.利用改良的CTAB法提取叶籽银杏和银杏的基因组DNA。经电泳检测,片段大小在23kb左右,DNA带整齐清晰,没有明显拖尾,提取的DNA纯度较高。用CTAB大量法提取叶籽银杏的RNA,电泳检测显示,28SRNA和18SRNA电泳条带清晰,不拖尾,并且28SRNA的亮度高于18SRNA的亮度,表明RNA完整性较好,没有降解。能用于分子克隆等后继分子生物学实验。2.用RT-PCR扩增的叶籽银杏GinLFYcDNA序列编码区全长为1209bp,用DNAman软件分析该序列显示其编码402个氨基酸,将该序列在GeneBank上注册,注册序列号为:GU563897。经BLAST分析表明,叶籽银杏GinLFY的cDNA序列与辐射松的PRFLL基因同源性是85%,罗汉松LEAFY基因的同源性为82%。与已注册银杏雌株的GinLFY基因核苷酸序列及氨基酸序列的同源性都高达99%。叶籽银杏的GinLFY基因组序列全长为3455bp,与cDNA序列多重比对后,该基因组序列含有2个内含子,3个外显子,大小分别为479bp、404bp和326bp。叶籽银杏GinNdly cDNA序列编码区全长为1209bp,用DNAman软件分析该序列,编码402个氨基酸。将该序列在GeneBank上注册,注册序列号为:GU563898。经BLAST分析表明,叶籽银杏GinNdly cDNA序列与红豆杉的NEEDLY-like基因,日本柳杉CjNdly基因,罗汉松的NEEDLY-like基因的同源性分别为:86%、83%、84%。与已注册银杏GinNdly基因核苷酸及氨基酸序列的同源性也都高达99%。叶籽银杏的GinNdly基因组序列全长为1504bp,与cDNA序列多重比对后,该基因组序列也含有2个内含子,3个外显子,大小分别为:449bp、428bp和332bp。3.测得的叶籽银杏GbMADS5基因序列含有666bp,将该序列在GeneBank上注册,注册序列号为:GU563899。序列分析表明该基因含有一个完整的开放阅读框,编码221个氨基酸,含有MADS区、I区、K区和C-末端,具有典型的MIKC型植物MADS-box基因结构。同源性比较显示,GbMADS5与苏铁AG、云杉DAL2、拟南芥AGL11的同源性分别为91.07%、83.33%、60.87%。构建的系统树显示,叶籽银杏的GbMADS5基因归于AG亚家族基因,与苏铁的亲缘关系最近。本文对叶籽银杏的LEAFY同源基因及MADS-box基因进行了研究探讨。该研究对叶籽银杏这一观赏资源的保护、利用和开发具有重要意义。
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