背景脑肠轴是肠与中枢神经系统之间的双向连接通路。肠道健康和相关的肠道微生物群稳态不仅影响胃肠道环境,还影响大脑功能。然而,肠功能障碍致脑损伤加重的机制尚不清楚。缺血性脑中风是致死致残的主要原因。因此,探索缺血性脑中风的内在神经保护策略就显得尤为重要。硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）是第三种气态分子,H2S一方面参与心脑血管系统的生理过程,另一方面,H2S在病理状态下在中枢神经系统、肠道、肾脏等器官中发挥重要作用。本研究首先通过建立脑缺血/再灌注（I/R）诱导的脑损伤与葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导的小鼠结肠炎模型,探讨缺血性脑损伤和结肠炎症是否相互促进,并探讨其连接因子是否为H2S。其次,探索H2S改善脑I/R损伤的机制是否与调控星形胶质细胞表型转换有关。本研究结果将为探索缺血性脑中风的神经保护靶点研究提供思路。目的:1.探讨缺血/再灌注（ischemia reperfusion,I/R）诱导的小鼠脑损伤与DSS诱导的结肠炎症是否相互促进。2.研究脑I/R损伤与结肠炎症相互促进是否与内源性H2S下调有关。3.阐明CSE源性H2S抑制RhoA/ROCK通路抗脑缺血再灌注损伤是否与调控星形胶质细胞活化为A2表型有关。方法:第一部分:硫化氢抗脑缺血/再灌注损伤和结肠炎症的相互促进作用1.双侧颈总动脉结扎法（common carotid artery,CCA）构建小鼠脑I/R模型;小鼠自由饮用七天3%的DSS诱导结肠炎模型。1.1健康雄性昆明小鼠随机分成5组,每组10只,对照组、结肠炎组、脑I/R组、脑I/R+结肠炎组、脑I/R+结肠炎+Na HS组。1.2通过观察小鼠生存率、体重下降百分比、结肠长度、疾病活动指数（disease activity index,DAI）判断小鼠结肠损伤情况。1.3旷场实验检测小鼠运动探究能力。1.4采用苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin,HE）和尼氏染色法观察海马区神经元损伤,采用HE染色观察结肠损伤。1.5 ELISA法检测小鼠血清神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）含量及脑组织和结肠组织裂解液中H2S的含量。1.6Western Blot检测脑组织以及结肠组织中胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）,胱硫醚β合成酶（L-cystathionine-β-synthetase,CBS）,3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）,Ras同源家族成员A（Ras homologue gene family member A,RhoA）,Rho蛋白激酶1（Rho kinase1,ROCK1）,Rho蛋白激酶2(Rho kinase 2,ROCK2,胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）,,S100钙结合蛋白A10（S100 calcium binding protein A10,S100A10）和C3的表达。第二部分:CSE源性H2S促进反应性星形胶质细胞活化为A2表型脑缺血再灌注损伤2.双侧颈总动脉结扎构建野生型（wild type,WT）和CSE敲除（knock out,KO）小鼠脑I/R模型。2.1实验分组:野生型C57BL/6和CSE基因敲除小鼠随机分成5组,每组10只,WT+假手术组、WT+I/R组、WT+I/R+Na HS（4.8 mg/kg）组;KO+I/R组、KO+I/R+Na HS（4.8 mg/kg）组。另取30只野生型C57BL/6小鼠随机分成3组:WT+假手术组、WT+I/R组、WT+I/R+Fasudil（10 mg/kg）组、每组10只。2.2旷场实验和水迷宫实验检测小鼠学习学习和运动探究能力。2.3采用HE染色法观察海马区神经元损伤情况。2.4酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量及脑组织RhoA蛋白活性、ROCK1蛋白活性、ROCK2蛋白活性以及脑组织裂解液中H2S的含量。2.5Western Blot检测RhoA,ROCK1,ROCK2,GFAP,S100A10和C3的表达。2.6免疫荧光法检测髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）和神经元核抗原（neuronal nuclei,Neu N）表达,以及免疫荧光双标法检测Brd U/GFAP,GFAP/S100A10,GFAP/C3共表达。结果:第一部分:硫化氢抗脑缺血/再灌注损伤和结肠炎症的相互促进作用1.结肠长度、体重下降百分比、疾病活动指数结果显示,与对照组相比,DSS造模后,结肠长度、体重下降百分比、疾病活动指数均减少,表明结肠炎造模成功。脑I/R+结肠炎组小鼠结肠长度和体重下降百分比、DAI评分增加较结肠炎组明显。给予Na HS（4.8 mg/kg）治疗后,可减轻小鼠结肠长度和体重下降百分比、DAI评分增加。2.旷场结果显示,与对照组相比,脑I/R组小鼠的总移动距离、移动速度、过线（过到相邻方格）、站立次数均显著降低,提示脑I/R可诱导小鼠行为障碍。相比之下,脑I/R+结肠炎组诱导的行为缺陷更为严重。给予Na HS（4.8 mg/kg）可显著阻断小鼠脑I/R和结肠炎引起的行为障碍。3.HE染色结果显示结肠炎组小鼠结肠组织组织学评分高于对照组和脑I/R组小鼠。虽然脑I/R对小鼠结肠组织组织学评分无影响,但脑I/R+结肠炎组小鼠结肠组织组织学评分高于结肠炎组小鼠。HE和尼氏染色结果显示,脑I/R组小鼠脑组织组织学评分高于对照组和结肠炎。虽然结肠炎组对小鼠脑组织组织学评分无影响,但脑I/R+结肠炎组小鼠脑组织组织学评分高于脑I/R组小鼠。Na HS可降低小鼠脑I/R和DSS诱导的结肠组织和脑组织组织学评分。4.ELISA试剂盒检测血清中炎症因子含量,包括IL-6和TNF-α。结果显示,与对照组小鼠相比,脑I/R组或结肠炎组引起的IL-6和TNF-α血清含量明显高于对照组小鼠的血清含量,表明结肠炎或脑I/R可能诱发炎症。但与结肠炎组和脑I/R组相比,脑I/R+结肠炎组诱导的IL-6和TNF-α的释放更为明显（P＜0.05）,Na HS可抑制这两种因子释放。5.Western Blot结果显示,与对照组小鼠相比,结肠炎小鼠结肠组织中CBS、CSE和3-MST的表达和H2S含量显著降低,而RhoA、ROCK1、ROCK2表达明显增加。脑I/R+结肠炎组进一步降低了内源性H2S合酶的表达,降低了结肠组织中H2S的含量,而升高了RhoA/ROCK通路蛋白表达（与结肠炎组相比,P＜?0.01）,Na HS可以抑制上述蛋白表达水平的变化。重要的是,在对照组和脑I/R组之间,小鼠结肠组织中H2S合酶和RhoA/ROCK通路蛋白表达没有显著差异。6.此外,在海马组织中,我们还发现CBS、CSE的蛋白表达和H2S的含量在脑I/R后显著降低,而RhoA、ROCK1、ROCK2表达明显增加（P＜?0.05,与对照组相比）。而结肠炎症对海马组织内源性H2S合酶和RhoA/ROCK通路蛋白表达无显著影响;但脑I/R后构建结肠炎症模型进一步抑制了海马组织中H2S合酶表达和抑制H2S含量以及升高RhoA/ROCK通路蛋白表达,Na HS可以抑制上述蛋白表达水平的变化。7.Western Blot结果显示,与对照组相比,结肠炎组结肠组织中GFAP表达降低,C3蛋白和S100A10表达下调。此外,与结肠炎组相比,脑I/R+结肠炎小鼠结肠组织中GFAP、C3蛋白和S100A10的降低更为显著。然而,脑I/R单独对结肠组织中GFAP的表达没有影响。Na HS治疗可显著阻断小鼠脑I/R后结肠炎所致GFAP和S100A10表达的降低;然而,它进一步降低了C3蛋白的表达。8.脑I/R诱导脑组织中GFAP、C3和S100A10蛋白上调,脑I/R+结肠炎小鼠脑组织中GFAP、C3和S100A10蛋白上调比脑I/R组小鼠更为显著;然而,结肠炎症对海马组织中GFAP的表达无影响。此外,我们发现外源性H2S供体Na HS对海马组织中GFAP和C3表达的增加有抑制作用,但可促进S100A10的表达。第二部分:CSE源性H2S促进反应性星形胶质细胞活化为A2表型抗脑缺血再灌注损伤1.旷场和水迷宫实验结果显示,与WT小鼠假手术组相比,I/R可导致WT小鼠的运动探索和学习记忆能力显著下降,但是KO小鼠脑I/R比WT小鼠脑I/R下降更明显;与CSE KO小鼠I/R组比较,给予Na HS治疗后CSE KO小鼠的运动探索和学习记忆能力明显改善。3.HE染色、Neu N和MBP免疫荧光染色结果显示,与WT小鼠假手术组相比,WT小鼠I/R组的脑组织海马区有明显的神经元损伤,但是KO小鼠脑I/R比WT小鼠脑I/R后神经元损伤更明显;而与KO小鼠脑I/R组比较,Na HS可明显改善CSE KO小鼠脑I/R后脑组织神经元损伤。4.ELISA检测小鼠血清中NSE和LDH的变化以及脑组织中RhoA活性、ROCK1活性、ROCK2活性和H2S含量。结果显示,与WT小鼠假手术组相比,I/R组WT小鼠血清中和脑组织中以上损伤因子有明显增加,但是KO小鼠脑I/R比WT小鼠脑I/R损伤更明显;而与KO小鼠脑I/R组比较,Na HS可明显抑制CSE KO小鼠脑I/R后NSE和LDH漏出。5.Western blot结果显示,与WT小鼠假手术组相比,小鼠脑I/R后海马RhoA、ROCK1、ROCK2、GFAP、C3和S100A10蛋白表达增加。此外,脑I/R诱导的RhoA、ROCK1、ROCK2、GFAP、C3和S100A10蛋白在CSE KO小鼠脑组织中的表达高于WT小鼠。然而,在WT sham和CSE KO sham小鼠海马中RhoA、ROCK1、ROCK2、GFAP、C3和S100A10蛋白的表达没有显著差异。给予Na HS可明显抑制RhoA、ROCK1、ROCK2、GFAP和C3表达的增加有抑制作用,但却促进了S100A10的表达。6.免疫荧光双染检测Brd U/GFAP、GFAP/C3、GFAP/S100A10共染细胞的结果显示,脑I/R后小鼠海马组织中Brd U/GFAP、GFAP/C3、GFAP/S100A10共定位的细胞数量增加（与假手术组相比;P＜0.01）。但脑I/R诱导WT小鼠海马组织中Brd U/GFAP、GFAP/C3、GFAP/S100A10阳性细胞的增加较CSE敲除小鼠更为显著。Na HS可显著抑制脑I/R诱导的小鼠海马组织中Brd U/GFAP、GFAP/C3共定位细胞数增加,促进海马组织中GFAP/S100A10阳性细胞的增殖。7.在野生型C57BL/6小鼠中,与假手术组相比,脑I/R组小鼠的运动探索和学习记忆能力显著下降,脑组织海马区有明显的病理损伤,同时RhoA、ROCK1、ROCK2、GFAP、C3和S100A10蛋白表达明显升高。与脑I/R组小鼠比较,给予10 mg/kg ROCK抑制剂Fasudil治疗后小鼠的运动能力、肢体协调能力以及脑组织海马区的病理损伤明显改善,同时RhoA、ROCK1、ROCK2、GFAP、C3和S100A10蛋白表达明显降低,差异有统计学意义。结论:1.脑I/R加重结肠炎小鼠肠道炎症,并且结肠炎症可加重脑I/R损伤;结肠炎症与脑I/R损伤的相互促进与内源性H2S减少及RhoA/ROCK通路上调有关。2.CSE源性H2S保护脑缺血再灌注损伤的机制与抑制RhoA/ROCK通路,促进反应性星形胶质细胞向A2表型转换有关。