中药材的配伍应用是中医用药的主要形式,在临床用药的过程当中,将两种或两种以上的药物进行混合则称之为配伍;而当几种药物按一定的法度加以组合,确定其中每种药物的比例,并有相对规定性的加工方法和使用方法,针对相对确定的病证,这种药物配伍则称之为复方,复方是药物配伍的发展,也是药物配伍应用的高级形式。但由于中药化学成分复杂,并且在配伍过程当中,药材中的主要化学成分可能会发生质和量的改变,这为研究中药配伍及复方的作用机制带来了一定的困难,从而阻碍了中医药理论的发展和应用。本文利用现代分析方法与技术,对“中药十八反”中人参与藜芦药对配伍和中药复方“甘草附子汤”中化学成分进行分析,在此基础上对主要化学成分的吸收转运和药效学进行研究,主要研究内容包括以下几个方面:1、人参藜芦药对中化学成分的分离鉴定首先利用高效液相色谱与质谱联用技术建立了分离人参单煎液和藜芦单煎液中主要化学成分的方法,并在正离子扫描模式下,对人参藜芦这对反药中的主要化学成分进行分析,根据精确分子质量、质谱碎片并结合相关文献分别鉴定出12种人参皂苷和8种藜芦生物碱。通过比较人参加入不同比例藜芦后几种人参皂苷峰面积的变化情况,发现大量藜芦的加入使一些人参皂苷的溶出减少,从而降低人参皂苷多方面的药理作用,即人参与藜芦配伍具有“减效”的作用;而比较藜芦加入不同比例人参后几种藜芦生物碱峰面积的变化情况,发现大量人参的加入使藜芦生物碱的溶出增加,从而增加藜芦生物碱的毒性作用,即藜芦与人参配伍具有“增毒”的作用。上述研究结果符合“中药十八反”配伍禁忌原则,也为研究人参与藜芦这对“反药”主要化学成分的体外吸收转运机制奠定了物质基础。2、人参与藜芦配伍前后化学成分吸收转运的变化通过建立Caco-2单层细胞模型在体外模拟人体小肠吸收过程,并利用高效液相色谱法与质谱法联用技术,研究人参与藜芦配伍前后主要化学成分吸收转运的变化情况,为进一步研究人参与藜芦配伍禁忌原则奠定基础。首先分别研究了时间、浓度两个因素对人参皂苷和藜芦生物碱双向转运的影响,发现人参皂苷和藜芦生物碱的双向转运均具有时间依赖性,并且吸收方向的转运也具有浓度依赖性,但人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd和藜芦生物碱的外排转运不受浓度的影响,不具有浓度依赖性,可能为某种转运蛋白的作用底物。通过对人参皂苷和藜芦生物碱吸收方向的回收率考察发现,除芥芬胺和藜芦胺的回收率较低,推测其可能与细胞发生特异性结合或在细胞酶系统作用下发生了代谢转化,其他6种生物碱及人参皂苷的回收率均在100%左右,说明未与细胞结合或发生代谢转化。人参与不同比例的藜芦配伍后,人参皂苷的小肠吸收度均降低,说明藜芦对人参发挥其药效作用具有一定的阻碍作用。而藜芦与一定比例的人参配伍后,藜芦生物碱的小肠吸收度升高,说明人参可促进藜芦生物碱的毒性作用。该研究结果从吸收转运的角度再次验证了中药“十八反”配伍禁忌原则。3、“甘草附子汤”中皂苷类成分的研究利用现代分析方法与技术,分析“甘草附子汤”中各单味药、药对及全方中皂苷类成分在配伍前后发生的质或量的改变,为阐明中药配伍过程中药效成分的变化提供有力依据。首先利用紫外分光光度法测得各样品溶液中总皂苷的含量,甘草、白术、桂枝分别与黑顺片配伍时,总皂苷含量均有所下降,推测是与黑顺片中生物碱发生反应以起到减毒功效。药渣中总皂苷含量的变化提示,甘草、白术和桂枝中的总皂苷有相互促进溶出的效果,分别与黑顺片配伍时总皂苷溶出增加,可能黑顺片中生物碱类成分促进皂苷类成分溶出,溶出的皂苷类成分又参与到减毒作用中。其次利用高效液相色谱法测得各样品溶液中甘草酸的含量,甘草与白术、桂枝配伍时,药对共煎皂苷提取液中甘草酸含量有所增加,而药渣中甘草酸含量下降,推测是白术和桂枝有促进甘草中甘草酸溶出的作用;而甘草与黑顺片配伍时,药对共煎皂苷提取液中甘草酸含量明显降低,药渣中甘草酸含量也下降,推测是黑顺片中生物碱类成分促进甘草中甘草酸溶出后又与其发生络合反应,从而起到减毒的作用。而比较复方合煎与复方分煎皂苷提取液,发现复方合煎皂苷提取液中甘草酸含量降低的更多,药渣中剩余的甘草酸也更少,说明在煎煮的过程中,甘草酸溶出增多并与生物碱发生络合反应较多,体现了中药复方各药材共同煎煮后再进行应用的重要性。最后利用高效液相色谱质谱联用技术分离鉴定含甘草药材的皂苷提取液,分析其中几种含量较高的化学成分在配伍前后质和量的变化,发现甘草与黑顺片配伍后,几种皂苷类化学成分含量均下降,推测可能是与黑顺片中生物碱类化学成分发生相互作用以起到减毒功效;甘草与白术和桂枝配伍后,皂苷类成分含量增加,推测白术和桂枝能促进甘草中几种皂苷类成分的溶出。4、“甘草附子汤”皂苷纯化工艺及抗氧化作用研究利用D101大孔吸附树脂建立了分离纯化“甘草附子汤”中皂苷组分的方法,该方法可使“甘草附子汤”皂苷组分与其他组分达到较好的分离,纯度可达到49%左右。抗氧化实验的研究结果表明,与甘草单煎液皂苷组分相比,桂枝和黑顺片与甘草配伍后的共煎液皂苷组分的抗氧化能力有所提升,推测桂枝中的酚酸类成分和黑顺片中的生物碱类成分发挥了协同抗氧化作用,并且“甘草附子汤”皂苷提取液的抗氧化能力高于其水提液,说明皂苷类成分具有较好的抗氧化能力,在“甘草附子汤”治疗风湿性、类风湿性疾病中发挥了重要作用。5、“甘草附子汤”中皂苷类成分吸收转运的体外研究药材配伍方面,甘草分别与白术、桂枝、黑顺片单煎合并液以及复方合并液与甘草单煎液相比,白术、桂枝和黑顺片均降低了甘草皂苷G2的小肠吸收度,提高了甘草酸的小肠吸收度;甘草分别与白术、桂枝、黑顺片配伍的共煎液以及复方共煎液与甘草单煎液相比,白术、桂枝和黑顺片均降低了甘草皂苷G2的小肠吸收度,白术提高了甘草酸的小肠吸收度,桂枝和黑顺片均降低了甘草酸的小肠吸收度。组分配伍方面,加入不同比例的黄酮组分后,四种皂苷类成分的Papp A-B值均降低,Papp B-A值和Er值均升高,即黄酮组分抑制了皂苷组分的吸收,促进了其外排,导致四种皂苷的小肠吸收度均降低。而加入不同比例的生物碱组分后,四种皂苷类成分Papp A-B值和Papp B-A值均升高、Er值均降低,即生物碱组分促进了皂苷组分的吸收和外排转运,最终导致四种皂苷的小肠吸收度均升高。标准品配伍方面,加入甘草苷及甘草素后,甘草酸的Papp A-B值、Papp B-A值和Er值均增加,即在有外排存在的情况下,甘草酸的实际吸收减少,小肠吸收度降低,说明黄酮类成分有拮抗甘草酸吸收的作用;加入单酯型和双酯型生物碱后,甘草酸的Papp A-B值、Papp B-A值和Er值均降低,即在有外排存在的情况下,甘草酸的实际吸收增加,小肠吸收度升高,说明生物碱类成分有协同甘草酸吸收的作用。6、“甘草附子汤”单味药、药对、复方及皂苷组分药理作用研究利用热板法、醋酸扭体法等动物实验模型,研究了“甘草附子汤”中单味药、药对、复方及皂苷组分的药理作用,发现单味药、药对、复方及皂苷组分均具有镇痛、抗炎和免疫调节的作用。在单味药、药对的药理作用研究方面,比较了白术、桂枝分别对甘草和黑顺片药理作用的影响,以及二者的相互影响。在皂苷组分药理作用研究方面,发现皂苷组分对外周性及中枢性疼痛的抑制作用,对角叉菜胶引起的急性炎症和大鼠佐剂性关节炎模型引起的足肿胀的抑制作用,以及对小鼠巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1和IL-2的抑制作用,均优于“甘草附子汤”复方。并且研究发现皂苷组分在与黄酮组分和生物碱组分配伍后,药理作用的强弱会发生不同程度的变化,这可能与二者影响皂苷组分的小肠吸收度有关,从而影响皂苷组分发挥其药理作用。上述研究结果,对中药配伍及中药复方的作用机制研究奠定了物质基础,同时对中药现代化研究提供了新的思路。