本论文分为四部分。第一部分 文献综述概括论述了甜叶菊化学成分和药理研究进展,并探讨了其药用价值。概括论述了甜叶菊主要的化学成分咖啡酰奎宁酸类化合物的研究概况。综述了 PK-PD联用技术在中药研究中的应用进展。并依此确定论文的立题依据及创新研究思路。第二部分 甜叶菊酚类有效部位体内外化学成分研究包括第一章-第二章本论文基于课题组前期建立的甜叶菊酚类部位的提取制备工艺,进行了中试制备工艺放大,制备了甜叶菊酚类有效部位,总酚的含量为53.78%,fla的含量为16.75%，符合制备工艺与质量标准要求。并综合采用多种分离方法,对甜叶菊酚类有效部位进行化学成分研究。最后综合运用现代波谱学分析鉴定出了 11个化合物,其中有2个新化合物,分别是TYJ-10为苯乙醇类成分,TYJ-12为糖苷类成分;还有6个化合物首次从该植物中分离得到分别是TYJ-7、TYJ-14、TYJ-15、TYJ-16、TYJ-19为苯乙醇类成分,TYJ-11为单萜类成分;进而阐明甜叶菊酚类有效部位的化学物质基础。总结了一些酚酸类成分、黄酮类成分和苯乙醇类成分结构的裂解规律,为后期甜叶菊酚类有效部位的HPLC-MS分析提供依据。采用预试反应分析甜叶菊酚类有效部位中成分的类型,表明甜叶菊酚类有效部位中除已经确定的酚类成分和鞣质类成分以外,可能含有糖类、黄酮类、香豆素类、木脂素类和醌类成分。建立了甜叶菊酚类有效部位的HPLC-PDA,HPLC-PDA-MS特征图谱分析方法,对其中的51个特征吸收峰化学类型进行了确认,通过添加对照品指认了 16个化学成分;并通过分析各特征峰的二级质谱方法,推测出19个可能的结构。采用UPLC-PDA方法指认了甜叶菊酚类有效部位的31个入血成分,其中11个成分为体外样品自然成分直接入血(原型入血),通过对照品指认,可确定原型入血成分有峰8为f1b、峰12为f1d、峰14为f1g、峰15为f1c、峰28为f1a、峰29为f1f、峰18为f2a、峰19为t1a、峰23为f3b、峰27为f3a;还有40个成分在体外样品含有而体内未发现,另外9个成分为体内发现,而在体外样品未找到对应峰,推测为新生代谢产物(代谢入血),可能由F1类、F3类、F2类或F4类等自然化学成分代谢产生;还有11个成分在空白血清中含有,有F2类成分和F4类成分,推测可能为内源性成分。第三部分 基于降血糖类药成分的甜叶菊体内外含量考量即第三章。通过对甜叶菊体内化学成分的研究,发现甜叶菊中的F1类、F2类和F3类成分等为其主要的降血糖类药组分,主要类药成分包括:F1类以fla为特性指标性成分、F2类以f2a为特性指标性成分,F3类以f3a为特性指标性成分。为了对甜叶菊降血糖类药成分在药材中的含量、酚类有效部位中的含量和大鼠血清中含量与比例的动态变化进行考量,也为进一步开展甜叶菊药代动力学表征研究提供测定手段。本试验首次采用UPLC建立基于甜叶菊主要降血糖类药成分f1a、f2a和f3a的甜叶菊质量控制方法,考量甜叶菊药材和酚类有效部位中主要类药成分含量。f1a、f2a、f3a分别在0.0401~1.202 μg、0.0084~0.2526 μg、0.0088~0.2652 μg质量范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,回收率分别为为98.18%、98.75%和97.47%。6份样品含量测定结果表明,该方法简便、准确、可靠,可用于甜叶菊中主要类药成分的含量测定,并可作为甜叶菊及其降血糖主要类药组分的质量控制方法之一。运用此方法对甜叶菊药材和酚类有效部位进行三类降血糖类药组分的含量考量。又基于原型入血的11个成分进行甜叶菊药材和酚类有效部位的关联分析,发现酚类有效部位中各原型入血成分的含量较药材都有不同程度的提高。还发现各原型入血成分在药材和酚类有效部位中的相对比例变化不大,说明甜叶菊酚类有效部位自然化学与制备化学吻合度较高。建立了大鼠血清中甜叶菊主要降血糖类药成分f1a、f2a、f3a的UPLC血药浓度测定方法。结果f1a、f2a、f3a血药浓度分别在0.0517~46.6μg/mL、0.731~658 μg/mL、0.0491~44.2 μg/mL范围内线性关系良好,萃取回收率均在75%以上,方法回收率在90%~110%之间,日内、日间精密度及稳定性的RSD均小于10%。测定结果表明,建立的方法准确可靠、灵敏度高,可较好地用于甜叶菊药代动力学研究。第四部分 高血糖模型下甜叶菊药物体系表征研究包括第四章-第六章1.在不同状态下对甜叶菊酚类有效部位PK-DI进行表征研究,基于甜叶菊特性类药成分f1a、f2a、f3a,对符合中药整体性的多层面甜叶菊酚类有效部位药代动力学表征进行了探讨,包括基于甜叶菊特性类药成分血药浓度、特性类药成分表达的相关类药组分血药浓度、特性类药成分表达的原型和代谢成分血药浓度比例综合表征的PK研究方法,获得了多层面PK特征和参数,为PK-PD-DI关联性研究提供药物体系信息支撑。采用已建立UPLC指标性类药成分测定方法,对甜叶菊入血成分的血药浓度进行测定,计算其药代动力学参数,并对血药浓度及相对组成比例进行动态的表征。采用四氧嘧啶(ALX)和链脲菌素(STZ)造高血糖模型,进行甜叶菊酚类有效部位多层面PK-DI表征研究。(1)甜叶菊酚类有效部位类药成分的达峰时间(Tmax)结果显示,正常状态下,出现2个协同吸收峰,时间分别为0.167h和4h。ALX(降糖)状态下,出现4个协同吸收峰,时间分别为0.083h、0.5h、1h和4h。ALX(糖耐量)状态下,出现3个协同吸收峰,时间分别为0.25h、1.5h和6h。STZ(降糖)状态下,出现5个协同吸收峰,时间分别为0.167h、0.5h、1.5h、2h和6h。STZ(糖耐量)状态下,出现5个协同吸收峰,时间分别为0.167h、0.5h、0.75h、2h和6h。结果表明同一类型或不同类型的类药成分在同一时间达峰,说明类药成分之间具有协同性,体现了中药多成分间协同吸收的药物特性。通过不同病理状态下协同时间点的比较分析,发现甜叶菊酚类有效部位的各入血成分发生协同吸收的三段时间点为:0.083～0.5 h、1~2 h和4~6 h。(2)甜叶菊酚类有效部位类药成分的最大血药浓度(Cmax)结果显示,对原型成分和代谢成分在不同生理状态下的Cmax进行对比,发现除峰15和峰28外,其他原型成分在病理状态下的Cmax均高于正常组,除峰17、20和24外,其他代谢成分在病理状态下的Cmax均高于正常组,说明原型成分峰8、12、14、29(F1类)、峰18(F2类)、峰19(T1 类)、峰 22、23、27(F3 类)和代谢成分峰 10、16(F2 类)、峰 13、21(F1 类)、峰30、31(F4类)在病理状态发挥药效时作用强度大。在同一生理状态下对不同原型和代谢成分的Cmax对比后,发现峰14、28(F1类)、峰18(F2类)、峰19(T1类)、峰22(F3类)这5个原型成分和峰10、16、24(F2类)、峰31(F4类)这4个代谢成分在不同病理状态下Cmax都高于其他原型和代谢成分,说明这5个原型成分和4个代谢成分对药物发挥药效时作用强度贡献度大。(3)甜叶菊酚类有效部位类药成分的曲线下面积(AUC)的结果显示,对原型成分和代谢成分在不同生理状态下的AUC进行对比,发现除峰8、15、28和29外,其他原型成分在病理状态下的AUC值均高于正常组,除峰17、30和31外,其他代谢成分在病理状态下的AUC值均高于正常组,说明原型成分峰12、14(F1类)、峰18(F2类)、峰19(T1类)、峰22、23、27(F3类)和代谢成分峰 10、16、24(F2类)、峰 13、20、21(F1 类)对不同病理状态的亲和性较正常状态要高。在同一生理状态下对不同原型成分的AUC值对比后,峰18(F2类)、峰19(T1类)、峰22、23(F3类)、峰28(F1类)这5个原型成分和峰10、16、24(F2类)、峰30、31(F4类)这5个代谢成分在不同病理状态下AUC值都高于其他原型成分和代谢成分,说明这些成分对不同病理状态的亲和性都较高。(4)甜叶菊酚类有效部位类药成分的半衰期(T1/2)和平均滞留时间(MRT)的结果显示,不同生理状态T1/2和MRT比较,发现原型的F1类成分(峰8、12、14、28、29)在病理状态下的T1/2和MRT要较正常状态有所缩短,说明F1类成分在病理状态下时在在体内驻留时间较短,体内代谢较快;代谢的F1类成分峰13、20、21病理状态下多数的T1/2和MRT要较正常状态有所缩短,说明峰13、20、21很有可能是原型F1类成分的代谢产物。还发现原型T1类成分峰19和F3类成分峰23、27多数的T1/2和MRT要较正常状态有所延长,而代谢F2类成分峰10、16、24和F4类成分峰30、31病理状态下的T1/2和MRT要较正常状态有所延长,说明峰10、16、24和峰30、31很有可能是原型F2类、F4类或F3类成分的代谢产物。这说明代谢类药成分来自原型类药成分,原型类药成分源于自然的酚类有效部位,体现了类药成分的自然性。2.在不同状态下对甜叶菊酚类有效部位PD-DI进行表征研究,为PK-PD-DI关联性研究提供PD数据。采用ALX和STZ造高血糖模型,根据药代曲线结果选择同样的时间点为药效实验的时间点,都采用降糖和糖耐量为药效指标对甜叶菊酚类有效部位降血糖药效动力学进行研究。采用SAS统计分析软件进行组间单因素方差分析,根据P值判定是否有显著性差异。确定ALX(降糖)实验的降糖药效按大小排序时间点为:1.5h、4h、0.25 h和0.75 h;ALX(糖耐量)实验的糖耐量药效按大小排序时间点为:0.5 h、0.167 h和1.5 h;STZ(降糖)实验的降糖药效按大小排序时间点为:6h、1.5h、2.5 h和0.25 h;STZ(糖耐量)实验的糖耐量药效按大小排序时间点为:1.5 h、0.75 h和0.167 h。在ALX和STZ造高血糖模型下,糖耐量实验的药效时间点均较降糖实验的药效时间点有所提前。药效时间点也分为三段:0.167~0.75 h、1.5~2.5 h和4~6 h。通过对不同病理状态下的药效时间点的类药成分贡献度进行分析,类药成分在不同的病理状态下贡献度不同,ALX(降糖)状态下,峰23>22>24>12>16>28>10>31>21>20>13>30>8>29>14>19>18>27>15;ALX(糖耐量)状态下,峰31>10>13>14>28>22>19>16>12>30>29>21>24>8>20>27>18>23>17;STZ(降糖)状态下,峰 24>17>23>22>19>28>14>18>29>21>12>20>13>16>31>15>30>27>10>8;STZ(糖耐量)状态下,峰 28>29>31>30>12>10>13>20>15>19>14>18>22>21>27>8>24>17。发现不同病理模型的共有协同成分有F1类成分峰 12、13、14、20、21、28、29,F3 类成分峰 22、27,F2 类成分峰 10、18、24,T1类成分峰19,F4类成分峰30、31。3.将高血糖模型下甜叶菊酚类有效部位指标性类药有效成分的血药浓度数据与药效数据汇总,进行PK-PD-DI关联分析。筛选甜叶菊酚类有效部位降血糖药物体系,并确定甜叶菊酚类有效部位的效应关联成分。(1)筛选出ALX造高血糖模型下甜叶菊酚类有效部位降糖的药物体系:F1类成分(峰 8、12、13、14、20、21、28、29)、T1 类(峰 19)、F2类成分(峰 10、16、18、24)、F3类成分(峰22、23、27)。这些药效成分的贡献度排序为:峰23>22>24>28>12>19>13>16>10>14>29>21>8>20>18>27;其中峰 22(F3 类，f3c)贡献度最大,且为原型成分,可作为ALX降糖状态的特性指标性成分。以峰28的血药浓度为基准1,其他成分与之作比,得到ALX降糖状态的原型药效成分和代谢药效成分间的最佳量组合关系如下:原型有效成分峰8:12:14:18:19:22:23:27:28:29=0.111:0.573:0.586:16.34:0.954:2.540:1.723:0.088:1:0.473,代谢有效成分峰 10:13:16:20:21:24=33.01:1.465:10.56:0.433:0.293:31.91。(2)筛选出ALX造高血糖模型下甜叶菊酚类有效部位糖耐量的药物体系:F1类成分(峰 8、12、13、14、20、21、28、29)、T1 类(峰 19)、F2 类成分(峰 10、16、18)、F3类成分(峰22、27)。这些药效成分的贡献度排序为:峰16>10>13>22>14>28>19>12>29>21>8>27>18>20;其中峰14(F1类,f1g)贡献度较大,且为原型成分,可作为ALX糖耐量状态的特性指标性成分。以峰28的血药浓度为基准1,其他成分与之作比,得到ALX降糖状态的原型药效成分和代谢药效成分间的最佳量组合关系如下:原型有效成分峰 8:12:14:18:19:22:27:28:29=0.174:0.547:0.728:1.419:0.803:0.567:0.077:1:0.399，代谢有效成分峰 10:13:16:20:21=15.39:3.519:3.463:0.308:0.215。(3)筛选出STZ造高血糖模型下甜叶菊酚类有效部位降糖的药物体系:F1类成分(峰8、12、13、14、15、20、21、28、29)、F2 类成分(峰 10、24)、F3 类成分(峰 22、23)、F4类成分(峰17、30、31)。这些药效成分的贡献度排序为:峰24>17>23>22>28>14>12>15>13>21>20>29>31>30>10>8;其中峰 23(F3 类，f3b)贡献度较大,且为原型成分,可作为STZ降糖状态的特性指标性成分。以峰28的血药浓度为基准1,其他成分与之作比,得到STZ降糖状态的原型药效成分和代谢药效成分间的最佳量组合关系如下:原型有效成分峰8:12:14:15:22:23:28:29=0.139:0.529:1.876:0.765:1.341:0.794:1:0.929,代谢有效成分峰 10:13:17:20:21:24:30:31=34.54:2.441:0.297:0.513:0.354:27.25:8.533:7.176。(4)筛选出STZ造高血糖模型下甜叶菊酚类有效部位糖耐量的药物体系:F1类成分(峰 12、13、14、15、20、21、28、29)、T1 类成分(峰 19)、F2 类成分(峰 10、18)、F3类成分(峰22)、F4类成分(峰30)。这些药效成分的贡献度排序为:峰28>29>30>13>12>19>20>18>14>22>15>10>21;其中峰28(F1 类,f1a)贡献度最大,且为原型成分,可作为STZ糖耐量状态的特性指标性成分。以峰28的血药浓度为基准1，其他成分与之作比,得到STZ降糖状态的原型药效成分和代谢药效成分间的最佳量组合关系如下:原型有效成分峰12:14:15:18:19:22:28:29=0.462:0.631:1.082:6.559:0.526:0.139:1:0.641,代谢有效成分峰 10:13:20:21:30=8.146:3.603:0.421:0.290:8.136。(5)筛选出的甜叶菊酚类有效部位降血糖的共有药物体系为:F1类成分(峰12、13、14、20、21、28、29)、F2类成分(峰10)、F3类成分(峰22)。其中F1类成分(峰12、14、28、29)和F3类成分(峰22)为原型有效成分,可作为甜叶菊降血糖的特性有效指标性成分,用于甜叶菊药材和酚类有效部位质量控制。通过指认,可知峰12为f1d、峰14为f1g、峰28为f1a、峰29为f1f、峰22可能为f3c。(6)根据PK-PD-DI关联分析,总结出药物体系的三大特性表征:自然性、协同性、亲和性。第五部分总结与讨论即第七章对各部分实验结果进行分析讨论,同时阐明了本论文的主要创新点:1对甜叶菊酚类有效部位进行了化学成分研究,分离鉴定出11个化合物,TYJ-10和TYJ-12为2个新化合物,并发现甜叶菊中新的一类组分-苯乙醇类成分。对51个特征吸收峰的化学类型进行了确认,指认了 16个化学成分,并推测出19个可能的结构。2首次建立了体内外同时测定f1a、f2a和f3a 3种不同化学类型降血糖类药成分含量的UPLC-PDA方法,并进行三类降血糖类药组分的含量考量,又基于原型入血的11个成分进行甜叶菊药材和酚类有效部位的关联分析。3首次对甜叶菊酚类有效部位在5种不同生理状态即正常组、ALX降糖组、ALX糖耐量组、STZ降糖组、STZ糖耐量组动物口服给药后的原型和代谢类药成分进行血清PK-DI研究,并进行PK-DI表征交汇关联分析,进而体现类药成分的自然性、协同性、亲和性。4首次对甜叶菊酚类有效部位在4种不同病理状态即ALX降糖组、ALX糖耐量组、STZ降糖组、STZ糖耐量组动物口服给药后的原型和代谢类药成分进行血清PD-DI研究,并进行PD-DI表征交汇关联分析,进而体现类药成分的协同性。5采用PK-PD-DI关联分析技术,首次对不同病理状态下甜叶菊酚类有效部位降血糖药物体系进行表征。筛选出原型有效成分,可作为甜叶菊药材和酚类有效部位质量控制的特性有效指标性成分。为将甜叶菊酚类有效部位开发成降血糖的五类新药提供药物化学依据。