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普鲁兰酶属于糖基水解酶第13家族,也称为αα-淀粉酶家族。由于其能够专一性的水解支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键而具有重要的工业应用价值。对Anoxybacillus sp.LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(PulA)晶体结构分析发现了一个新的结构域(CBM68),该结构域截断实验发现对该酶的酶学性质有影响,为进一步研究该结构域,对该结构域功能位点进行了研究。在新命名的底物结合域CBM68中预测出9个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62、V91、G92、R96、N370、G371和Y372),分别将9个氨基酸位点突变为丙氨酸,得到突变体 Y14A、D16A、K62A、V91A、G92A、R96A、N370A、G371A和Y372A。根据米氏方程测定动力学参数,其中,突变酶Y14A和R96A的底物结合力及催化效率与PulA相比均有明显降低,其Km值分别比PulA提高了 4.2倍和2.5倍,Kcat/Km分别为PulA的29%和37%。同时,Y14A和R96A的最适作用温度均降低了10℃,特别是R96A在60℃时的半衰期从48h降为8h。通过氨基酸与底物模拟分析,范德华力、氢键或蛋白结构柔性的改变,使得突变酶酶学性质发生了较大的变化。V91A、G92A的Km值分别为PulA的30%、38%,V91A的催化效率提高了 16.7%,而G92A的催化效率仅为PulA的18.4%,但该酶在65℃酶活仍有78.5%,比野生型PulA酶活提高了 43%。等温滴定量热法对V91A、G92A与底物互作实验,经分析这两个突变体亲和力变化是由范德华力主导的。可见Y14、V91、G92和R96是CBM68结构域中与底物结合的关键氨基酸位点。通过定向进化的方法,将四个位点分别设计为不同性质的氨基酸。成功构建了 16个突变体,测定动力学及热力学参数,结果显示改变保守的芳香族氨基酸对酶的催化大多都是不利的;V91和G92分别突变为相同的氨基酸,两者的Km值及催化效率变化相反,说明这两个氨基酸与底物的相互作用机制并不相同;R96突变结果显示,突变为同种性质的氨基酸(Lys、His)与其他性质的氨基酸(Ser、Glu)相比,同种性质的氨基酸提高了蛋白亲和力与催化效率。可见,氨基酸间的相互作用非常复杂,现在对其作用机制尚不明确,这四个位点的发现也为进一步探究CBM68结构域的作用机制奠定了一定的基础。