子痫前期（preeclampsia）指妊娠第20周以后,以新发高血压和蛋白尿为主要症状产科疾病,严重者可出现头痛、眼花、肺水肿、恶心、呕吐、肝肾功不全等症状。它是一种严重的世界范围的产科疾病,是导致孕妇和新生儿的发病率和死亡率升高的主要原因,全世界每年发病率为3%-5%。目前针对子痫前期尚无有效治疗手段,及时分娩是唯一治疗方法。这种治疗方法带来的后果包括早产,胎儿发育不全,产妇及胎儿多器官受损等后果。目前对子痫前期的发病机制探究尚不明确,并且在诊断和治疗方面缺少理想的生物标志物和治疗靶点。因此,子痫前期的致病基因筛选及其作用机制的研究对于子痫前期的早期诊断和治疗具有重大的意义。由于环状RNA在哺乳动物体内具有高度保守性和特异性,并且在组织中表达丰度较高,适合成为诊断子痫前期的生物标志物。随着研究的发现,环状RNA被认为参与子痫前期的发生过程。因此,进一步了解环状RNA在子痫前期的发生中发挥的作用具有十分重要的意义。本研究通过环状RNA微阵列筛选出环状RNAVRK1,探究其对滋养细胞生物学行为特别是侵袭能力的影响和与子痫前期发病的关系,希望有助于子痫前期的诊断和治疗。第一部分:子痫前期中环状RNA微阵列分析目的:通过环状RNA微阵列分析,筛选出子痫前期患者胎盘和正常妊娠妇女胎盘中差异表达的环状RNA,绘制表达图谱,对微阵列数据进行质控,分析样本间表达水平,并且进行生物信息学分析,包括环状RNA结构分析和分类、GO功能富集、KEGG通路富集,为子痫前期的诊断和治疗提供新的生物标志物和治疗靶点。研究方法:本部分研究选取了在中国医科大学附属第一医院产科进行剖宫产的10名孕妇的胎盘组织,分为早发型子痫前期组和正常妊娠组,进行微阵列分析,筛选出显著差异表达的环状RNA;对微阵列数据进行质控分析、聚类分析、表达定位分析;对差异表达的环状RNA亲本基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。结果:1.根据微阵列数据,以FC比值大于2和p小于0.01为筛选标准,筛选出273个差异表达的环状RNA。2.GO功能富集显示,差异表达环状RNA的亲本基因的基因主要与细胞代谢、细胞结合、核酸相关。3.KEGG通路富集显示,差异表达环状RNA的亲本基因主要与细胞粘附、细胞代谢相关。结论:环状RNA微阵列配合聚类分析、GO功能富集和KEGG通路富集分析有助于筛选出与子痫前期发病相关的环状RNA分子。第二部分:探究circVRK1对于滋养细胞迁移和侵袭能力、EMT的影响目的:在差异表达的环状RNA中,结合FC比值和p值,我们筛选出了一个新型环状RNA分子,即circVRK1。接下来探究circVRK1的环状结构,在子痫前期胎盘中的表达情况,分析其与子痫前期发病的相关性。体外实验探究circVRK1在滋养细胞中的表达定位和对滋养细胞迁移和侵袭能力、EMT的影响。生物信息学预测circVRK1影响滋养细胞生物学行为的机制。研究方法:qPCR明确circVRK1在子痫前期患者胎盘中表达水平;HTR-8/Svneo人滋养细胞培养;PCR、q PCR、Sanger测序明确circVRK1的环状结构;免疫荧光验证circVRK1在滋养细胞的表达定位;小干扰RNA和短发夹RNA转染HTR-8/Svneo细胞;transwell实验和划痕实验明确circVRK1对于滋养细胞迁移和侵袭能力的影响;免疫印迹实验明确EMT相关蛋白表达水平;应用Targetscan、mi Randa和circinteractome分析下游因子,并且绘制网络图;SPSS、Graphpad Prism用于数据统计和绘制图表。结果:1.circVRK1在子痫前期患者胎盘中表达水平显著升高,高于正常妊娠妇女。2.circVRK1是一种由VRK1第2-11外显子反向剪接后形成的一种环状RNA。3.circVRK1广泛表达于滋养细胞细胞质中。4.敲低circVRK1的表达,HTR-8/Svneo细胞迁移和侵袭能力明显增强。5.敲低circVRK1的表达,HTR-8/Svneo细胞由上皮细胞表型向间质细胞表型转化（EMT）。6.根据“ce RNA”理论,应用生物信息学预测circVRK1的下游微小RNA和m RNA。结论:circVRK1在子痫前期胎盘中表达水平明显升高,可能与子痫前期的发病存在直接关系。circVRK1是一种在细胞质中表达的外显子类环状RNA。circVRK1抑制滋养细胞的迁移,侵袭和上皮间质化过程。第三部分:探究circVRK1影响滋养细胞生物学行为的机制目的:探究circVRK1影响子痫前期滋养细胞迁移和侵袭能力、EMT的作用机制。研究方法:生物信息学分析、RNA pull down实验、双荧光素酶报告基因探究下游靶向micro RNA;使用小干扰RNA、短发夹RNA、miRNA mimics、miRNA inhibitor、质粒共转染HTR-8/Svneo细胞;q PCR细胞检测相关基因表达;免疫荧光实验明确circVRK1和下游micro RNA的表达定位;transwell实验和划痕实验明确对滋养细胞迁移和侵袭能力的影响;免疫印迹实验检测EMT相关蛋白表达水平。结果:1.circVRK1存在mi R-221-3p结合位点,敲低circVRK1的表达,miR-221-3p表达水平显著升高。2.过表达mi R-221-3p后,HTR-8/Svneo细胞的迁移和侵袭能力、EMT明显增强。3.circVRK1和mi R-221-3p广泛表达于滋养细胞细胞质中。4.与si-circVRK1/sh-circVRK1组相比,共转染si-circVRK1/sh-circVRK1和mi R-221-3p inhibitor后,HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭和EMT被逆转。5.与si-circVRK1/sh-circVRK1组相比,共转染si-circVRK1/sh-circVRK1和PTEN后,HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭和EMT被部分逆转。6.敲减circVRK1后,Akt磷酸化水平明显提高,共转染si-circVRK1/sh-circVRK1和mi R-221-3p inhibitor或si-circVRK1/sh-circVRK1和PTEN后,这种效应被部分逆转。结论:circVRK1作为一种竞争性内源性RNA,可以通过结合mi R-221-3p,调控PTEN的表达和Akt的磷酸化,进而影响滋养细胞的迁移、侵袭和EMT进程。