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研究背景在职业活动中长期吸入结晶型二氧化硅（Crystalline Silica,CS）引起的矽肺病,严重威胁职业人群健康,是全球重大公共卫生问题。缺乏有效治疗和逆转矽肺病措施,患者会出现呼吸功能损伤甚至呼吸衰竭。因此,矽肺病潜在的发病机制和治疗靶点需要进一步阐明。矽肺病表现为进行性不可逆的肺纤维化。肺纤维化是以成纤维细胞增殖分化,大量细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）聚集为特征。根据矽肺发展特征可分为早期炎症阶段和晚期肺纤维化阶段,肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages,AMs）是游离于肺泡空间的主要免疫细胞,在矽肺两个阶段中均发挥调节作用。AMs表型取决于所处环境,在不同细胞因子微环境下,AMs可极化为经典激活（Classically activated）的M1亚型和替代激活（Alternatively activated）的M2亚型。研究显示AMs极化参与CS诱导的肺纤维化发展,但CS诱导AMs极化的确切作用及其机制尚未完全阐明。目的1.通过检测矽肺模型小鼠不同时间AMs极化改变,探讨CS诱导肺纤维化与AMs极化的时效关系。2.检测矽肺模型小鼠肺组织中调控AMs向M2亚型极化相关分子,探讨CS诱导肺纤维化中促进AMs向M2亚型极化的分子机制。3.使用IL-4中和抗体（IL-4 Neutralizing antibody,IL-4 NA）预处理矽肺模型小鼠,探讨IL-4 NA对CS诱导肺纤维化的干预效果。方法第一部分CS诱导肺纤维化与AMs极化的时效关系8周龄C57BL/6J WT小鼠随机分为CS组和生理盐水（Normal saline,NS）组,每组48只。CS组和NS组小鼠分别气管滴注100μL 20 mg/m L CS混悬液或NS,并在3、7、28、56天时,收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测M1（F4/80+CD11c+）亚型和M2（F4/80+CD206+）亚型AMs比例,q RT-PCR检测AMs中i NOS、Arg-1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-βm RNA水平,ELISA检测BLAF中i NOS、Arg-1活性和IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β、IL-4浓度,用Pearson相关分析AMs中M2亚型比例和IL-4浓度的线性关系。然后处死小鼠分离肺组织,用HE染色和Masson染色分别观察肺组织炎症和纤维化,并用羟脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）检测试剂盒检测HYP水平;蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting,WB）和免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测E-钙粘素（E-cadherin,E-cad）、波形蛋白（Vimentin,Vim）和α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ）表达水平。第二部分:CS诱导AMs向M2型极化的机制研究CS或NS暴露28天,分离小鼠AMs,用q RT-PCR检测调控AMs向M2型极化相关分子Fox O-1、BMP-4、CEBP-β、AMPK-α、KLF-4、B7-H3、STAT-3、PPAR-γ、PTP1B、STAT-6、TIPE-2、IRF-4 m RNA表达水平,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测AMs中KLF-4、p-STAT-6、PPAR-γ蛋白表达水平。第三部分IL-4 NA对CS诱导肺纤维化的干预效果8周龄C57BL/6J WT小鼠随机分为NS组、CS组、CS+Ig G组、CS+IL-4NA组,每组12只。NS组、CS组处理方式同上,CS+Ig G组和CS+IL-4 NA组小鼠气管滴注100μL 20mg/m L CS混悬液,同时,每周腹腔注射100μL 10 mg/m L Ig G或IL-4 NA,各组小鼠暴露28天后处死。收集BALF,用ELISA检测BALF中IL-4的浓度,FCM检测M1亚型和M2亚型AMs比例,用q RT-PCR检测AMs中Arg-1、IL-10、TGF-β、PPAR-γ、STAT-6、KLF-4 m RNA水平,ELISA检测BLAF中Arg-1活性及IL-10、TGF-β浓度。分离肺组织,用HE染色和Masson染色观察肺组织结构和纤维化,并检测HYP表达水平;WB和IHC检测肺组织E-cad、Vim、α-SMA和COL-Ⅰ表达水平。结果1.CS暴露诱导小鼠早期肺组织炎症,晚期肺纤维化相比NS组,CS组小鼠暴露3天,肺组织结构被破环,肺间质出现炎症细胞浸润,暴露7天,肺组织炎症消退,肺实质增加,暴露至56天,矽肺结节形成。CS组小鼠暴露3天或7天,肺组织中蓝色胶原纤维积聚不明显,暴露28天或56天,肺组织中可见索条状和片状蓝色胶原纤维,HYP表达水平显著升高（P＜0.05）。相比NS组,CS组小鼠暴露28或56天,肺组织E-cad的表达水平显著降低,而Vim、COL-Ⅰ、α-SMA表达水平显著升高（P＜0.05）。2.CS暴露诱导小鼠AMs早期向M1亚型极化,晚期向M2亚型极化相比NS组,CS组小鼠暴露3天,M1亚型AMs比例显著增加（P＜0.05）,暴露7、28或56天,M1亚型AMs比例均显著减少（P＜0.05）。相比NS组,CS组小鼠暴露3天,i NOS的m RNA水平和活性,IL-1β、TNF-α、IL-6的m RNA水平和浓度显著升高;暴露7、28或56天,i NOS的m RNA水平和活性,IL-1β、TNF-α、IL-6的m RNA水平和浓度显著下降（P＜0.05）。相比NS组,CS组小鼠暴露28、56天,M2亚型AMs比例显著增加（P＜0.05）;Arg-1的m RNA水平和活性,IL-10、TGF-β的m RNA水平和浓度显著上升（P＜0.05）。3.CS暴露上调小鼠AMs中STAT-6/KLF-4/PPAR-γ信号通路分子表达相比NS组,CS组小鼠暴露28天,AMs中STAT-6、KLF-4、PPAR-γm RNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。4.CS暴露小鼠M2亚型AMs比例与IL-4细胞因子相关性相比NS组,CS组小鼠暴露28或56天,BFLA中IL-4含量显著升高（P＜0.05）。用Pearson相关分析显示,CS组小鼠暴露28、56天,AMs中M2亚型比例与BFLA中IL-4含量均呈现显著正相关（r=0.963,P＜0.05;r=0.956,P＜0.05）。5.IL-4 NA对CS诱导肺纤维化的干预效果5.1 IL-4 NA抑制CS诱导AMs向M2亚型极化相比NS组,CS组、CS+Ig G组、CS+IL-4 NA组小鼠暴露28天,M1亚型AMs比例显著降低（P＜0.05）。相比NS组,CS组和CS+Ig G组小鼠暴露28天,M2亚型AMs比例显著升高（P＜0.05）;相比CS组和CS+Ig G组,CS+IL-4 NA组小鼠M2亚型AMs比例显著降低（P＜0.05）。Arg-1 m-RNA水平和活性及TGF-β、IL-10的m-RNA水平和浓度与M2亚型AMs比例变化趋势相同。5.2 IL-4 NA对肺纤维化具有缓解作用相比NS组,CS组和CS+Ig G组小鼠暴露28天,肺组织结构紊乱,实质增加,胶原纤维沉积明显,使用IL-4 NA后,有效改善肺组织结构紊乱和减少胶原纤维沉积。相比NS组,CS组和CS+Ig G组小鼠暴露28天肺组织Vim、COL-Ⅰ和α-SMA表达水平显著升高（P＜0.05）;相比CS组和CS+Ig G组,CS+IL-4 NA组,肺组织Vim、COL-Ⅰ和α-SMA表达水平显著降低（P＜0.05）。相比NS组,CS组和CS+Ig G组小鼠暴露28天,肺组织E-cad表达水平显著降低（P＜0.05）,相比CS组和CS+Ig G组,CS+IL-4 NA组,肺组织E-cad表达水平显著回升（P＜0.05）。5.3 IL-4 NA抑制CS激活STAT-6/KLF-4/PPAR-γ信号通路相比NS组,CS组和CS+Ig G组小鼠暴露28天,AMs中STAT-6、KLF-4、PPAR-γm RNA表达水平显著升高（P＜0.05）,相比CS组CS+IL-4 NA组,AMs中STAT-6、KLF-4、PPAR-γm RNA表达水平显著下降（P＜0.05）。结论1.CS暴露早期促进AMs向M1亚型极化诱导肺组织急性炎症,晚期促进AMs向M2亚型极化介导肺EMT和FMT诱导肺纤维化。2.机制上,CS可能激活STAT-6/KLF-4/PPAR-γ信号通路促进AMs向M2亚型极化。3.IL-4 NA抑制CS诱导AMs向M2亚型极化,缓解肺EMT和FMT减轻肺纤维化,机制上,IL-4NA可能抑制CS激活KLF-4/STAT-6/PPAR-γ信号通路抑制AMs向M2亚型极化。