论文部分内容阅读
脓毒血症肾损伤(sepsis associated acute kidney injury,SA-AKI)是一种宿主应对感染性打击产生的以肾小球滤过率突然降低、血清肌酐增加或者少尿为特征的常见临床危重症候群,其居高不下的发病率和死亡率极大地消耗了公共卫生资源。因此,从研究脓毒血症肾损伤病理生理机制出发,深入挖掘其紧密相关的特异性通路及靶点一直是医学界的难点和热点。LIGHT(Homologous to Lymphotoxins,exhibits Inducible expression,and competes with HSV Glycoprotein D for HVEM,a receptor expressed by T lymphocytes),即肿瘤坏死因子超家族的第14号成员,作为一个新兴的免疫调节分子自发现之日起受到业界广泛关注。通过与单纯疱疹病毒介质(Herpesvirus entry mediator,HVEM)相互作用,LIGHT信号可以产生共刺激信号以激活T细胞并使其增殖,引起细胞因子和炎性因子的产生,从而促进促炎反应。此外,LIGHT分子与淋巴毒素受体(Lymphotoxinβreceptor,LTβR)结合也可能增加趋化因子和粘附分子的释放,从而诱导免疫细胞募集以加速免疫反应。因此,作为“双刃剑”一般的双向免疫调节分子,LIGHT能通过促进或者抑制炎症反应进而调控各种炎症或自身免疫性疾病的发生。脓毒血症肾损伤本质上是宿主对感染性打击产生的炎症反应“失控”继发的肾脏功能障碍,其中“失控”的炎症反应是其瀑布效应的起点。为此,我们推测LIGHT通路可能通过调节炎症参与脓毒血症肾损伤的病理生理过程,因此它可能成为一个新的干预靶标。Toll受体(Toll-like receptors,TLRs)是天然免疫系统中最重要的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)的之一,它既可以识别病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),也可以被人体自身细胞损害或与危险相关的分子模式(Danger-associatedmolecularpatterns,DAMPs)相关的内源性分子激活。当TLRs被激活后,转录因子NF-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)被释放入核进而导致IL-1,IL-2,IL-6,IL-12和TNF-α等许多炎症介质的产生及释放。此外,TLRs还通过抗原呈递细胞参与自适应免疫系统的激活,这些抗原呈递细胞促进CD4辅助细胞的分化,B细胞的活化和抗体的产生。其中,TLR4作为TLRs家族的重要成员,已有研究证实参与了缺血再灌注、顺铂诱导的肾损伤及新月型肾小球肾炎肾脏疾病的发展。在LPS诱导的脓毒血症肾损伤中,TLR4-NF-κB通路激活被认为炎症反应的级联放大的关键环节。一旦NF-κB活化入核可引起IL-6、TNF-α等炎症分子风暴的释放,进而激活白细胞、内皮细胞和上皮细胞,导致白细胞和血小板活化、微血管功能障碍、缺氧和组织损伤。相反,TLR4-NF-κB通路一旦被抑制,则能显著缓解脓毒血症肾损伤的发展。上述研究表明TLR4-NF-κB参与脓毒血症肾损伤的发生发展。然而,LIGHT通路是否参与脓毒血症肾损伤的发病抑或是否通过调控TLR4-NF-κB通路介导脓毒血症肾损伤的发生发展,目前未见相关研究报道。研究目的1.研究LPS诱导的体内、外脓毒血症肾损伤模型与LIGHT-HVEM/LTβR通路表达的相关性。2.引入同C57背景LIGHT基因缺陷小鼠和野生型小鼠,明确LIGHT-HVEM/LTβR通路在LPS诱导的小鼠脓毒血症肾损伤的作用。3.探讨LIGHT-HVEM/LTβR通路参与调控LPS诱导的体内、外脓毒血症肾损伤模型的作用机制。研究方法1.LPS诱导的脓毒血症肾损伤模型中LIGHT及受体HVEM、LTβR的表达(1)建立LPS腹腔注射诱导的小鼠脓毒血症肾损伤模型,WB、RT-PCR、IHC等技术检测LIGHT及HVEM、LTβR受体的表达变化,IF、激光共聚焦等技术检测LIGHT及HVEM、LTβR受体与CK-18的共定位情况。(2)建立LPS诱导HK-2细胞损伤模型,WB、RT-PCR、IF等检测LIGHT及受体的表达变化。2.LIGHT-HVEM/LTβR通路对LPS诱导的小鼠脓毒血症肾损伤的影响(1)LPS腹腔注射(40mg/kg)建立致死模型,对比野生型小鼠和LIGHT基因敲除小鼠的生存率。(2)LPS腹腔注射(20mg/kg)建立脓毒血症肾损伤模型,建模后24小时,处死小鼠。(1)收集小鼠血清,行生化检查,比较小鼠肌酐、尿素氮等肾功能差异。(2)行石蜡包埋、HE染色,观察野生型小鼠和LIGHT基因敲除小鼠肾组织的损伤程度,并行病理评分。(3)透射电镜观察野生型小鼠和LIGHT基因敲除小鼠肾组织的超微结构损伤。(4)通过ELISA、RT-PCR技术检测野生型和LIGHT基因敲除小鼠血清和肾组织中炎症相关因子(TNF-α,IL-1β,IL-6等)、肾损伤标志物(KIM-1、NGAL)的表达,及IHC、IF、MPO试剂盒等手段检测局部巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞浸润。(3)利用HVEM-Fc、LTβR-Fc融合蛋白提前24小时及2小时腹腔注射预处理野生型小鼠后,腹腔注射LPS(20mg/kg)建模,对比阻断LIGHT通路后小鼠的肾功能、病理损伤。3.LIHGT-HVEM/LTβR加重体内、外脓毒血症肾损伤模型的机制(1)体内实验中,LPS建模后24h,采用RT-PCR、IHC、WB等技术检测野生型和LIGHT基因敲除小鼠肾组织TLR4-Myd88-NF-κB的表达水平。(2)体外实验中,引入TAK242(TLR4抑制剂)、外源性重组LIGHT蛋白与LPS共刺激HK-2细胞,CCK-8检测细胞活力,电镜观察细胞损伤等表现,RT-PCR检测HK-2细胞分泌的炎症因子。(3)体外实验中,利用RT-PCR、IHC、WB等技术检测经不同分组刺激后TLR4-Myd88-NF-κB的表达水平,IF、激光共聚焦等手段检测NF-κB的表达及入核情况。研究结果1、LPS诱导的体内、外脓毒血症肾损伤模型中LIGHT及受体的表达(1)体内模型中,与生理盐水注射组对比,LPS诱导建模后,LIGHT及受体HVEM、LTβR在肾组织中表达明显升高,且与肾小管上皮细胞标志物CK-18高度共聚。(2)体外模型中,LPS刺激HK-2细胞后,HK-2细胞中LIGHT及HVEM、LTβR表达显著升高,且主要表达在胞膜。2、LIGHT-HVEM/LTβR通路对小鼠脓毒血症肾损伤的作用(1)在脓毒血症肾损伤模型中,与野生型小鼠相比,LIGHT基因敲除小鼠肌酐、尿素氮、KIM-1、NGAL等显著降低。(2)在脓毒血症肾损伤模型中,与野生型小鼠相比,LIGHT基因敲除小鼠病理损伤减轻,病理损伤评分显著降低。(3)在脓毒血症肾损伤模型中,与野生型小鼠相比,LIGHT基因敲除小鼠血清及局部肾脏组织炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)表达及炎症细胞浸润显著降低。(4)在脓毒血症肾损伤模型中,HVEM-Fc和LTβR-Fc提前24小时和2小时预处理野生型小鼠后,与单纯LPS注射组比较,肌酐、尿素氮、病理损伤评分显著降低。3、LIGHT信号通路参与调控脓毒血症肾损伤的机制(1)体内模型中,与野生型小鼠相比,LIGHT基因敲除小鼠肾脏组织TLR4-MyD88-NF-κB通路表达降低。(2)在体外模型中,外源性重组LIGHT蛋白联合LPS刺激HK-2细胞后,与单用LPS刺激对比,细胞活力显著下降,凋亡比例有所增加;(3)在体外模型中,外源性重组LIGHT蛋白联合LPS刺激HK-2细胞后TLR4-MyD88-NF-κB通路表达显著增加;(4)在体外模型中,TAK242(TLR4抑制剂)一定程度上可逆转重组LIGHT蛋白加重的LPS致HK-2细胞损伤,抑制了细胞活力下降及凋亡,并下调TLR4-MyD88-NF-κB通路表达。结论本研究通过体内、外实验,主要得出以下结论:(1)LIGHT信号通路与脓毒血症肾损伤密切相关。(2)LIGHT信号通路显著加重脓毒血症肾损伤,HVEM-Fc和LTβR-Fc预处理阻断LIGHT通路可明显减轻肾损伤。(3)LIGHT通路通过上调TLR4-Myd88-NF-κB的表达促进炎症因子分泌及炎症细胞浸润,从而导致脓毒血症肾损伤加重。