目的:通过观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂利拉鲁肽干预糖尿病大鼠后胰腺自噬相关标志物LC3BmRNA及其蛋白表达的变化,光镜观察胰腺脂肪沉积情况;加用氯喹阻断自噬通路后,比较上述指标变化,探讨自噬与胰腺脂肪沉积的关系及利拉鲁肽通过调节自噬改善胰腺脂肪沉积的作用机制。方法:以糖耐量正常大鼠(NGT组)作为对照,建立糖尿病大鼠模型,成模后随机分为三组:生理盐水对照组(DMNS组)、利拉鲁肽干预组(DMLIR组)及利拉鲁肽+氯喹组(DMLIR+CQ组)。DMNS组皮下注射生理盐水作为空白对照,DMLIR组皮下注射利拉鲁肽,观察利拉鲁肽干预后大鼠胰腺自噬水平及胰腺脂肪沉积的变化,DMLIR+CQ组皮下注射利拉鲁肽及自噬抑制剂氯喹,观察在利拉鲁肽基础上阻断自噬通路后胰腺脂肪沉积的变化。1.糖尿病大鼠模型制备:以36只4~5周龄的健康雄性Wistar大鼠为研究对象,体重180~200g,每笼6只,适应性喂养1周后,采用简单随机抽样法分为糖耐量正常组(NGT组,10只)和糖尿病组(DM组,26只)。NGT组以基础饲料喂养,每克饲料提供热量13.4kJ,其中脂肪占10.2%,蛋白质占23.3%,碳水化合物66.5%。DM组以高糖高脂饲料喂养,每克饲料提供热量21.8kJ,其中脂肪占56.0%,蛋白质占7%,碳水化合物37.0%。早晚各喂养1次,饮水自由。饲养环境:光照12小时,室温18~22℃,相对湿度30%~70%,每2周测大鼠体重、空腹血糖(FBG)。12周时,NGT组FBG为4.4~4.9 mmol/L,DM组血糖为5.3~5.9mmol/L,隔夜禁食12h后,DM组大鼠腹腔注射链脲佐菌素溶液(25mg/Kg),NGT组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72h后鼠尾采血测FBG,以FBG≥7.8mmol/L并持续一周以上为糖尿病造模成功,其中dm组造模成功25只,死亡1只。ngt组大鼠血糖均在正常范围内。2.大鼠分组及检测指标:糖耐量正常组(ngt组,10只)继续予基础饲料喂养。造模成功后,25只糖尿病大鼠采用简单随机抽样法分为三组:生理盐水对照组(dmns组,n=9)、利拉鲁肽干预组(dmlir组,n=8)及利拉鲁肽+氯喹组(dmlir+cq组,n=8),三组继续予高糖高脂饲料喂养。dmlir组以100ug/kg每天两次腹部皮下注射利拉鲁肽溶液,dmlir+cq组以100ug/kg每天两次腹部皮下注射利拉鲁肽溶液,并以50mg/kg每三天一次腹腔注射氯喹溶液,dmns组、ngt组腹部注射等体积生理盐水,每周测定各组大鼠体重及fbg。上述药物干预大鼠4周后,隔夜禁食12h后,测定体重,鼠尾采血测定fbg、50%葡萄糖注射液灌胃(4ml/kg)2小时后测定2hbg。次日空腹腹腔注射20%乌拉坦溶液(4ml/kg)麻醉大鼠,开腹后经腹主动脉取血,测定空腹胰岛素(fins)、甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl-c)。取三块约100mg的胰腺组织,锡箔纸包裹于液氮罐中保存,待行实时荧光定量pcr测定lc3bmrna水平,通过扩增曲线使用2-△△ct进行线性转换后进行定量计算。以脾脏为标记,取胰腺尾部浸泡于10%甲醛液固定48h后石蜡包埋,备做病理切片,用于免疫组化测定lc3b蛋白的表达,显色结果采用scanscopegs扫描仪分析,随机选取5个lc3b蛋白阳性表达区域,在400倍视野下计算染色区域的灰度值(灰度值与蛋白表达水平呈反比),取平均值进行统计分析。光镜下随机选取5个视野,40倍物镜下计算胰岛内空泡细胞与胰岛细胞总数的比值,取平均值评价胰腺脂肪沉积情况。分离内脏脂肪、称重,并计算内脏脂肪与体重的比值即内脏脂肪相对含量(vf/w)。3.统计学方法:上述指标均为计量资料,以均数±标准差表示,运用spss13.0统计软件分析。ngt、dmns、dmlir、dmlir+cq四组实验数据均满足正态分布和方差齐性。组间比较采用单因素方差分析(anova)、lsd检验。dm组lc3bmrna与fbg、tg、tc、fins、vf/w、空泡细胞/总胰岛细胞的相关性采用pearson相关分析,通过多元逐步回归法确定自噬的影响因素,以p≤0.05为差异有统计学意义。结果:1.各组大鼠一般特征比较:适应性喂养期间,大鼠饮食量、体重无明显差异,精神状态良好,毛色光泽。造模期间,dm组大鼠较ngt组大鼠饮食量、体重均增加,dm组大鼠体型肥胖、少动。造模成功后,药物干预期间,ngt组大鼠饮食量较前无变化,体重呈稳定增长;dmns组大鼠较同期ngt组大鼠体重增加,少动;dmlir组大鼠较同期dmns组大鼠饮食量、体重均下降,精神状态良好;dmlir+cq组大鼠精神萎靡,有脱毛现象,较同期dmns组大鼠饮食量、体重均下降,与同期dmlir组大鼠比较,饮食量、体重无差别。与ngt组比较,dmns组大鼠vf/w升高,差异有统计学意义(p﹤0.05);与dmns组比较,dmlir组大鼠vf/w降低,差异有统计学意义(p﹤0.05);dmlir+cq组大鼠vf/w差异无统计学意义(p>0.05)。2.各组大鼠生化指标比较:与ngt组比较,dmns组大鼠fbg、2hbg、fins、tg、tc、ldl-c升高,hdl降低,差异有统计学意义(p﹤0.05)。与dmns组比较,dmlir组大鼠fbg、2hbg、fins、tg、tc、ldl-c降低,hdl升高,差异有统计学意义(p﹤0.05);dmlir+cq组fbg、2hbg、hdl降低,fins、tg、tc、ldl-c升高,差异有统计学意义(p﹤0.05)。3.各组大鼠胰腺自噬水平及脂肪沉积比较:与ngt组比较,dmns组大鼠lc3bmrna及蛋白表达、空泡细胞/总胰岛细胞升高,差异有统计学意义(p﹤0.05)。与dmns组比较,dmlir组大鼠lc3bmrna及蛋白表达升高、空泡细胞/总胰岛细胞下降,差异有统计学意义(p﹤0.05);dmlir+cq组大鼠lc3bmrna及蛋白表达下降、空泡细胞/总胰岛细胞升高,差异有统计学意义(p﹤0.05)。光镜下观察胰腺脂肪沉积情况:ngt组大鼠胰腺由团索状的胰岛及周围外分泌部腺泡组成,胰岛散在分布,结构规则,胰岛内细胞排列紧密,细胞核呈圆形并居中,细胞内无明显脂滴,细胞间有丰富的血窦。dmns组大鼠胰腺小叶间纤维增生,胰岛细胞排列紊乱,间隔增宽,部分胰岛细胞内可见脂滴,形成空泡细胞。dmlir+cq组胰岛内胰岛细胞排列松散,胰岛内血管数量增多,扩张,胰岛细胞内脂滴明显增多,细胞核被推挤变形。dmlir组胰岛组织结构呈现逆转,胰岛细胞数量较dmns组明显增加,但胰岛细胞间排列不紧密、分布不均一,少数空泡脂滴散在分布。4.自噬相关因素分析:LC3B mRNA水平与FBG、TG、TC、FINS、胰岛素抵抗指数、空泡细胞/总胰岛细胞呈正相关(P<0.05),胰岛素抵抗指数是影响糖尿病大鼠自噬水平的独立因素。结论:1.糖尿病阶段存在胰腺脂肪沉积及自噬代偿性激活。2.利拉鲁肽通过增强糖尿病大鼠胰腺自噬,减少胰腺脂肪沉积,同时改善糖脂代谢。