研究背景和目的糖尿病肾病(DN)是糖尿病最为常见而严重的微血管并发症，是导致终末期肾病(ESRD)的重要原因，由于其发病机制尚未明确，治疗仍是一大难题。肾小球系膜病变是DN最为突出的早期表现，系膜细胞肥大、细胞外基质(ECM)异常积聚及由此导致的肾小球硬化是DN进展的关键环节。多年以来，国内外医学认为DN的发生及发展是多种因素综合作用的结果，但是目前临床实践证明，针对多种靶点的治疗仍未能有效地遏制DN的发病及发展，因此，尽快阐明其发病分子机制以及确立切实有效的治疗措施，是防治DN最急需解决的一个关键问题。miRNA是近年来发现的一类内源性、非编码的单链小RNA，通过与其靶基因的3’非翻译区(3’-UTR)碱基互补配对结合，在转录后水平直接导致mRNA的降解和(或)翻译过程的抑制，负性调控靶基因蛋白的表达，在生物体的发育分化、器官形成、细胞增殖、凋亡甚至疾病的发生中发挥重要的作用，已成为近年来研究的热点。目前,越来越多证据表明miRNA的异常表达与DN的发生、发展密切相关，然而其参与DN的发生机制尚不明确，有待于进一步研究。我们前期通过基因芯片分析了2型糖尿病db/db小鼠肾脏组织miRNA表达谱，其中以肾脏特异性miRNA—miR-215的表达水平升高尤为显著，但是它的靶基因和功能并不明确。本研究旨在通过对肾脏特异性miR-215的研究，阐明其在db/db小鼠DN发生、发展过程中的表达变化规律，通过生物信息学分析及双荧光素酶报告确证其可能的靶基因，初步探讨miR-215参与DN发生、发展的机制。对象和方法一、miR-215在db/db小鼠DN发生发展过程中和高糖刺激小鼠肾小球系膜细胞(MMCs)的表达变化规律1.采用4周龄的C57BL/KsJ背景的2型糖尿病肾病动物模型db/db小鼠(实验组)及同周龄的db/m小鼠(对照组)作为动物实验对象，分别在两组小鼠4、8、12、16周龄时,测量各组小鼠体重(BW)，留取24h尿液和血标本，检测24h尿白蛋白排泄量(UAE)及血糖(Glu)变化；并对小鼠肾脏组织进行PAS染色，光镜下观察肾脏组织的病理改变。明确db/db小鼠DN的病理进程。2.应用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测不同周龄(8、12、16周龄) db/db小鼠肾脏组织及高糖(30mmol/L)刺激MMCs (6h、12h、24h、48h)后miR-215的表达变化规律。二、miR-215靶基因的预测及验证1.应用在线靶基因预测软件TargetScan (http://www.targetscan.org); PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de); microRNA.org (http://www.microrna.org)对miR-215的靶基因进行预测，选择三种计算方法均能预测到的靶基因作为miR-215可能的潜在靶基因。并通过Gene Ontology (GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库对靶基因的生物学功能进行分析，最后我们找出与DN相关的靶基因即连环蛋白-β互动蛋白1(CTNNBIP1)，并应用RNA Hybrid软件对预测的靶基因CTNNBIP1的3’-UTR与相应的miR-215互补结合位点的核苷酸序列的自由能进行分析。2.应用qRT-PCR及Western blot检测不同周龄(8、12、16周龄) db/db小鼠肾脏组织及高糖(30mmol/L)刺激MMCs (6h、12h、24h、48h)后CTNNBIP1的表达变化规律，免疫组化进一步观察CTNNBIP1在db/db小鼠肾脏组织的表达分布情况。3.靶基因报告质粒的构建及双荧光素酶报告进一步验证MMCs中miR-215对其靶基因CTNNBIP1的直接调控作用。4、应用gain-and loss-of-function的设计理念，利用miR-215mimic和miR-215inhibitor转染MMCs，从正反两个方面证明miR-215对CTNNBIP1的表达和其下游关键信号分子β-catenin活性的调控作用。结果一、db/db小鼠BW、Glu和UAE的动态变化4周龄时，db/db小鼠BW较db/m小鼠增加(P<0.05)，但Glu及UAE均无明显差异。8周龄时，db/db小鼠BW、Glu和UAE均明显增加(均P<0.05)，提示8周龄时db/db小鼠已发生DN，尚处于DN早期。此后，随着周龄的增长，db/db小鼠BW、Glu及UAE逐渐升高(均P<0.05)，这些结果提示，db/db小鼠随着Glu的升高，DN不断进展。二、db/db小鼠肾脏病理动态改变不同周龄db/m小鼠肾脏组织均无明显改变。db/db小鼠在4周龄时肾脏组织未见异常改变；8周龄时肾脏组织出现肾小球肥大；12周龄时肾小球系膜细胞显著增生；16周龄出现肾小球系膜基质大量积聚和K-W结节等典型的DN病理改变。结果进一步提示，db/db小鼠随着周龄的增加，DN不断进展。三、db/db小鼠肾脏组织及高糖刺激MMCs miR-215表达的动态变化与同周龄的db/m小鼠比较，在小鼠8、12、16周时，db/db小鼠肾脏组织miR-215的表达均显著增高(均P<0.05)；并且，随着周龄的增加，miR-215在db/db小鼠肾脏组织的表达逐渐上升，呈明显的时间依赖性(均P <0.05)；同时，miR-215的表达随高糖刺激MMCs时间的延长进行性升高，其表达量在刺激细胞48h时达到高峰(均P<0.05)。提示：miR-215在DN环境下表达明显上调，其表达量随时间进展而进行性升高。这些结果说明，miR-215参与了DN的发病过程。四、miR-215靶基因预测分析应用在线靶基因预测软件Targetscan, PicTar和miRanda对miR-215的靶基因进行预测，先找出三个软件中预测到的miR-215的靶基因的交集，其中共筛选出8个靶基因，包括：Alcam，Blcap，Bhlhe22，Ctnnbip1，Cdc6，Pkp4，Wnk1，Msn；通过GO注释和KEGG数据库从这8个预测靶基因中找出miR-215最可能调控的与DN相关的靶基因为CTNNBIP1。生物信息学分析表明：CTNNBIP1是一种新发现的β-catenin结合蛋白，它可以与Tcf/Lef转录因子竞争性地与β-catenin结合，从而负性调控Wnt/β-catenin信号途径。并且，通过RNA Hybrid软件预测，在CTNNBIP1的3’-UTR区有一个与miR-215部分互补的位点，其结合的最小自由能是-17.3kcal/mol，提示：这一位点对于miR-215而言具有可接近及结合性。这些结果提示，CTNNBIP1可能是与DN相关的miR-215的靶基因。五、db/db小鼠肾脏组织及高糖刺激MMCs CTNNBIP1表达的动态变化与同周龄db/m小鼠比较，在小鼠8、12、16周时，db/db小鼠肾脏组织CTNNBIP1的mRNA表达量均显著降低(均P<0.05)，并且，随着周龄的增加，db/db小鼠CTNNBIP1mRNA的表达呈进行性下调的趋势(均P <0.05)，而db/m小鼠则无明显变化。db/db小鼠肾脏组织CTNNBIP1蛋白表达改变与mRNA表达变化一致，8、12、16周db/db小鼠肾脏组织CTNNBIP1的蛋白表达量较同周龄的db/m小鼠表达均下调(均P<0.05)。并且，进一步研究发现CTNNBIP1主要表达于肾小球系膜区，12周db/db小鼠肾小球系膜区阳性染色较同周龄的db/m小鼠显著减少，CTNNBIP1蛋白表达明显降低(P<0.05)。提示：随着周龄的增加，DN的进展，db/db小鼠肾脏组织CTNNBIP1的表达量进行性降低；同时，CTNNBIP1mRNA和蛋白的表达量随高糖刺激MMCs时间的延长呈进行性降低的趋势，提示：miR-215的表达量与CTNNBIP1的表达量呈显著负相关。这些结果说明，miR-215可能在DN进展过程中调控CTNNBIP1的表达。六、双荧光素酶报告证实miR-215对CTNNBIP1的直接调控成功构建CTNNBIP1mRNA3’-UTR荧光素酶报告质粒(pMIR-CTNNBIP1-3’UTR)，以转染空质粒(pMIR-REPORT载体)的MMCs为对照组，以海肾荧光素酶活性为内参，将萤火虫荧光活性与海肾荧光活性的比值表示相对荧光素酶活性。转染miR-215mimic与重组载体pMIR-CTNNBIP1-3’UTR的细胞荧光素酶表达强度相对于对照组显著降低(P<0.05)，说明miR-215能够直接作用于CTNNBIP1的3’-UTR，抑制重组载体荧光活性的表达。这些结果提示，CTNNBIP1是miR-215的靶基因。七、miR-215mimic/inhibitor转染MMCs后CTNNBIP1表达和β-catenin活性变化为了证实miR-215对MMCs CTNNBIP1/β-catenin通路的调控作用，细胞转染miR-215mimic/inhibitor48h后观察CTNNBIP1mRNA和蛋白表达变化，并分析其下游信号通路关键分子β-catenin的活性改变。与对照组比较，转染miR-215mimic过表达MMCs miR-215明显降低CTNNBIP1mRNA和蛋白的表达量，β-catenin的表达活性显著增强(均P <0.05)；而转染miR-215inhibitor抑制MMCs miR-215表达后，CTNNBIP1的mRNA和蛋白表达水平显著增加，β-catenin的活性明显降低(均P<0.05)。这些结果提示，miR-215可能通过调控CTNNBIP1/β-catenin通路参与DN的发病过程。八、miR-215对MMCs增殖活性的影响为了进一步明确miR-215能否影响MMCs的增殖活性，我们转染miR-215mimic/inhibitor上调或者沉默内源性miR-215的表达后，应用MTT法检测MMCs的增殖活性，结果发现，与对照组比较，过表达miR-215可明显增加细胞的增殖活性，然而，下调MMCs miR-215的表达后，细胞的增殖活性显著降低(均P <0.05)。这些结果提示，miR-215可能通过调控CTNNBIP1/β-catenin通路影响MMCs的增殖活性，从而介导了DN的发生发展。结论一、miR-215在db/db小鼠肾脏组织和高糖刺激的MMCs中均显著升高，呈明显的时间依赖性，初步在整体动物和细胞水平证实miR-215参与了DN的发病过程。二、应用在线靶基因预测软件预测及双荧光素酶报告进一步证实CTNNBIP1是miR-215的靶基因。生物信息学分析表明： CTNNBIP1是一种新发现的内源性Wnt/β-catenin信号通路的负性调控分子。三、db/db小鼠肾脏组织CTNNBIP1的mRNA和蛋白表达明显减少，其表达量随DN的进展而进行性降低，miR-215的表达量与CTNNBIP1的表达量呈显著负相关。过表达miR-215能够明显抑制MMCs CTNNBIP1的表达，增加β-catenin的表达活性和细胞的增殖活性；而抑制miR-215可显著增加CTNNBIP1的表达，下调β-catenin的表达活性，同时，细胞的增殖活性也明显降低。提示miR-215可能通过调控CTNNBIP1的表达影响Wnt/β-catenin信号通路参与DN的发生发展。