肝癌相关标志蛋白的检测是肝癌诊断、治疗的重要手段,对肝癌的诊断、转移、治疗、转归有着重要的参考价值。目前对于肝癌相关标志蛋白的检测主要包括胶体金法、酶联免疫吸附法、免疫比浊法和化学发光法等,但这些方法都存在一定的缺陷,如灵敏度较低,操作复杂和需要大型仪器等,这对于肝癌的早期诊断极为不利。电化学检测方法具有快速、灵敏、不需要大型仪器等优点,为肝癌相关标志蛋白的快速、灵敏检测提供了新的平台。本论文中,我们基于纳米材料和酶辅助的信号放大策略提出了一系列肝癌相关标志蛋白电化学检测新方法,实现了肝癌相关标志蛋白的高灵敏、快速检测,并对新方法的各种性能进行了评价。研究工作分为以下几个部分:1.基于银纳米颗粒电位溶出技术的AFP-L3电化学检测新方法研究甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是肝癌诊断的重要标志物,然而,AFP特异性并不高,在一些非肝癌疾病,如慢性肝炎、肝硬化患者的血清中也会增高。AFP-L3是AFP的一种异质体,特异性强,对于肝癌的诊断具有重要价值。在这部分工作中,我们基于功能化的银纳米颗粒(AgNPs)和小扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin,LCA)提出了一种AFP-L3电化学检测的新方法,实现了对AFP-L3快速而灵敏的检测。首先,合成生物素化小扁豆凝集素修饰的银纳米颗粒(B-LCA-AgNPs),借助小扁豆凝集素和AFP-L3之间作用的特异性作用,B-LCA-AgNPs可直接与AFP-L3结合并通过AgNPs产生电化学信号,实现对AFP-L3的检测。与现有的临床检测方法相比,本方法无需对AFP-L3进行分离,大大简化了检测步骤。此外,B-LCA-AgNPs和AFP-L3相互识别后,AgNPs通过亲和素-生物素相互作用可大量沉积在电极表面,从而实现电化学信号的放大,实现了对AFP-L3高灵敏检测。在这项工作中,我们用该方法对人血清样品中AFP-L3进行了检测,结果证明具有良好的特异性和稳定性。以上结果表明,我们构建的AFP-L3电化学检测新方法在肝癌的临床诊断中具有巨大的应用前景。2.基于双功能金纳米颗粒电化学信标的fuc-gp73检测新方法研究高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)在临床上已被广泛应用于肝癌的诊断,其虽然在肝癌患者血清中含量增高,但在慢性肝炎病人、肝硬化病人的血清中含量也有增高的现象,而进一步研究发现,岩藻糖基化的高尔基体蛋白73(fuc-gp73)只在肝细胞癌(HCC)病人的组织中增高,是区分肝癌与其他肝脏疾病一个重要标准。在本部分工作中,我们基于GP73巯基化的适配体和亲和素标记的小扁豆凝集素修饰的金纳米颗粒(A-LCA-AuNPs)提出了一种fuc-gp73电化学检测新方法。AuNPs较大的比表面积,不仅为A-LCA的固定提供了条件,而且实现了 fuc-gp73高灵敏的检测。此外,生物素标记的辣根过氧化物酶(B-HRP)可以通过亲和素-生物素的相互作用修饰在AuNPs表面,因此通过双功能化的AuNPs可以极大提高fuc-gp73分析的灵敏度。我们利用该方法对血清中的fuc-gp73进行了检测,结果显示该方法具有良好的精确性,选择性和重现性,为肝癌的早期、特异性诊断提供了一种新手段。3.基于DNA-G四联体-Hemin的甲基化转移酶1的电化学检测新方法研究研究发现DNA甲基化在肝癌的发生、转移和预后中起着重要作用。在本部分工作中,我们基于尿嘧啶特异性切割试剂(USER)诱导G-四链体脱氧核酶形成提出了一种灵敏的电化学方法实现了对DNA甲基转移酶1(DNMT1)的超灵敏检测。实验中,我们将含有DNMT1的识别序列的双链DNA固定在金电极表面,其中一条链(DNAS1)富含G碱基序列,互补链(DNAS2)含有丰富的胞嘧啶序列和一个甲基化的胞嘧啶,经过DNMT1甲基化后,半甲基化CG识别序列发生甲基化,经过重亚硫酸盐处理后,DNAS2中胞嘧啶转化为尿嘧啶,从而被USER切割,DNA S1中的胞嘧啶因为发生甲基化,无法转化为尿嘧啶,从而避免了 USER的切割,加入K+和Hemin后,形成G-四联体脱氧核酶,从而产生与DNMT1活性成正比的电化学信号。此外,抑制实验研究表明,在160mM的S-腺苷甲硫氨酸的存在下,SGI-1027抑制DNMT1活性的IC50为6 mM,与之前的报道一致。同时该方法能够在复杂的生物样品中有效地检测人DNMT1活性。以上结果表明,我们提出的DNMT1电化学检测方法在DNA甲基化相关的临床实践和生化研究中有较大的应用潜力。4.基于核酸外切酶Ⅲ辅助的端粒酶电化学检测新方法研究研究表明端粒酶的异常表达在肝癌的发生、发展过程中起着关键作用,研究者对肝癌组织中端粒酶活性的研究表明,肝癌中端粒酶的阳性率远远高于慢性肝炎组织、肝硬化组织和癌旁组织,而正常肝组织并没有端粒酶活性。在论文本部分工作中,我们基于功能化的纳米磁珠和核酸外切酶Ⅲ辅助的放大策略构建了一种电化学检测新方法,实现了对肿瘤细胞端粒酶活性的检测。在这一方法中,互补的探针可以与延长的端粒酶引物重复序列杂交,杂交产物通过磁性分离后,端粒酶引物重复序列链被核酸外切酶Ⅲ识别和切割。然后,释放的互补探针能够杂交并打开多个亚甲基蓝(MB)标记的发夹(HP)DNA探针,经过核酸外切酶Ⅲ的二次切割后,互补探针又可以进入下一个与MB标记的发夹样结构杂交的循环,而MB标记的探针与金电极表面的捕获探针结合,从而产生与端粒酶活性呈正比的峰电流值。利用核酸外切酶Ⅲ辅助的循环放大策略,该检测方法能够在单细胞水平检测端粒酶活性。该方法中,端粒酶的延长是在一个匀相的溶液进行的,然后通过磁珠进行分离纯化,能够除去细胞裂解产物中存在的干扰物,避免假阴性结果的产生,为检测实际样本中的端粒酶活性提供了新的思路。此外,为了证明我们提出的方法具有筛选端粒酶抑制剂的潜在应用价值,我们使用该方法成功地检测到端粒酶活性被3叠’-脱氧胸苷抑制,因此我们构建的电化学检测方法为端粒酶检测及端粒酶抑制剂的筛选提供了一种新手段,具有较大的潜在应用价值。5.基于铜离子级联催化信号放大策略的β-连环蛋白电化学检测新方法研究在肝癌中,β-连环蛋白与转录因子相互作用来调控肿瘤远处转移。在论文本部分工作中,我们基于铜离子级联催化信号放大策略提出了一种β-连环蛋白活性电化学检测的新方法。该方法利用多肽的蛋白靶向配体,通过电化学催化交联实现非共价键的分子识别、结合,并通过铜离子的氧化还原产生与β-连环蛋白丰度成比例的信号。此外,铜离子作为催化剂,在电极表面氧化产生电活性的分子可以有效放大电化学信号,实现β-连环蛋白的高灵敏检测,检测限达10pM(信噪比为3:1)。用该方法对临床样本进行检测时,β-连环蛋白的细胞分布、表达与样本的病理分级平行,进一步证明β-连环蛋白在促进肿瘤转移中起着重要作用。以上结果表明,该方法有望作为一种预测肝癌侵袭和转移的潜在工具。6.肝癌微环境中硫酸酯酶活性的电化学分析新方法研究肿瘤的发展、转移与细胞外基质酶活性有着密切的关系。在论文本部分工作中,我们构建了一种硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)的丰度和硫酸化程度,及HS和生长因子的相互作用的电化学检测新方法方法来评估肝癌微环境中硫酸酯酶的活性,并研究了硫酸酯酶在生物环境中对肝癌发展的作用。该方法的构建元件包括一个多肽探针和一个光催化剂(多吡啶钌配合物),该多肽探针序列来自淀粉样肽,而通过多吡啶钌配合物可以获得更加灵敏的信号输出。通过该方法,我们可以评估HepG2细胞中调控成纤细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)介导的细胞增殖的硫酸酯酶2的活性和丰度,也可以评估HS的硫酸化程度及其与生长因子结合的亲和力。最后,我们利用该方法分析了肝癌的临床组织样品,结果显示,可以通过上述研究中的HS生化特征指示肿瘤发展、转移等相关的改变。因此,我们构建的方法对肝癌转移的诊断和预后判断有着重要价值。