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多形性胶质母细胞瘤(GBM)是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性脑肿瘤,肿瘤的高侵袭性生长的特点使患者预后不佳,中位生存期仅有12个月左右。因此,阐明胶质瘤细胞侵袭的分子机制和探索新的治疗靶点意义重大。人体内钠离子平衡是维持机体正常组织微环境的重要因素,高钠对肿瘤侵袭性生长具有重要意义。渗透压转录因子NFAT5是细胞渗透压稳态以及肿瘤细胞迁移和侵袭的关键调节因子,在多种肿瘤中的研究表明NFAT5通过整合素信号通路的激活促进肿瘤的迁移和侵袭。整合素介导的“粘着斑”(FA)蛋白复合物与细胞外基质(ECM)的粘附在胶质瘤向周围正常组织的侵袭中发挥重要作用。我们旨在研究Na~+/NFAT5轴对GBM黏附与侵袭的影响以及具体作用机制。方法:第一部分:验证GBM组织中Na~+浓度和NFAT5表达特点:(1)收集83例胶质瘤患者手术标本(取自天津市环湖医院神经外科),通过免疫组织化学染色和蛋白质印迹分析不同WHO分级GBM组织和邻近正常组织中NFAT5表达情况。(2)通过Kaplan-Meier分析研究NFAT5表达高低与胶质瘤患者预后关系。第二部分:体外实验研究Na~+/NFAT5轴对GBM细胞黏附和侵袭的影响以及具体作用机制。(1)利用CRSIPR/cas9技术在GBM细胞系中进行NFAT5的敲除,构建NFAT5稳定敲除GBM细胞株,通过Western blot研究Na~+/NFAT5轴对GBM细胞EMT指标表达的影响,通过划痕实验、Transwell实验研究Na~+/NFAT5对GBM细胞的迁移和侵袭能力的影响。(2)通过转染NFAT5过表达慢病毒构建NFAT5过表达GBM细胞系,进一步研究NFAT5促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭的具体机制。通过m RNA测序分析NFAT5基因功能;通过细胞-细胞外基质黏附实验研究NFAT5与GBM细胞黏附作用的相关性;通过Western blot检测NFAT5高表达GBM细胞中整合素信号通路相关蛋白表达情况;通过活细胞监测实验验证NFAT5对GBM细胞在细胞外基质中运动迁移能力的影响;通过免疫荧光检测GBM细胞中NFAT5对细胞黏着斑转位的影响;通过CHIP实验验证NFAT5对integrinβ3的转录调控作用。第三部分:体内实验验证Na~+/NFAT5轴对GBM细胞黏附和侵袭的影响。Luciferase慢病毒感染胶质瘤细胞系U251和U251-NFAT5细胞,在小鼠颅内建立胶质母细胞瘤原位模型。并定期通过小动物活体生物发光法测量小鼠的肿瘤体积。选用免疫组织化学染色法检测EMT相关指标以及黏附相关蛋白表达水平。在体内实验中验证NFAT5调控GBM细胞的黏附和侵袭。结果:(1)Na~+浓度和NFAT5表达水平在胶质瘤中明显高于正常脑组织,而且胶质瘤组织中Na~+浓度和NFAT5表达随着胶质瘤WHO级别的升高而升高。Kaplan-Meier分析表明,NFAT5的高表达与患者总生存期较短有关。(2)Western blot实验证明Na~+/NFAT5轴促进GBM细胞EMT进程、划痕实验、Transwell实验表明Na~+/NFAT5轴促进GBM细胞的迁移和侵袭;m RNA测序分析表明NFAT5基因功能富集在细胞黏附相关信号通路;黏附实验表明NFAT5促进GBM细胞与细胞外基质的黏附;Western blot实验证明NFAT5促进GBM细胞中integrinβ3和p-FAK(Tyr397)的表达;活细胞监测实验证明NFAT5促进GBM细胞在细胞外基质中运动迁移能力;黏着斑蛋白的免疫荧光染色说明GBM细胞中NFAT5促进细胞黏着斑的成熟和转位;CHIP实验证明NFAT5对integrinβ3存在转录调控作用。综上,体外实验证实NFAT5在GBM中的上调通过激活整合素信号通路影响粘着斑的更新进而促进GBM细胞的黏附和侵袭。(3)在GBM原位动物模型中,Na~+/NFAT5轴促进了小鼠体内GBM细胞的黏附和侵袭。结论:(1)NFAT5在胶质瘤中表达升高并且与患者不良预后密切相关;(2)NFAT5胶质瘤细胞中通过调控整合素信号通路促进黏着斑的转位进而促进胶质瘤细胞的黏附侵袭能力;(3)体内外实验结果一致。