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胰岛素作为机体内唯一能够降低血糖的激素，该类药物对于胰岛素的分泌或作用缺陷造成的慢性高血糖引发糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱进而造成多种并发症的各种类型糖尿病，尤其是胰岛素依赖型糖尿病的治疗非常重要。胰岛素药物上市已长达八十年，制备方式由最初的动物来源逐渐被基因重组表达代替，而分子生物学及基因工程技术的发展，以及对胰岛素分子结构与功能的研究，使得具有不同特点的胰岛素类似物种类得以扩充，临床地位也愈发重要。由诺和诺德公司研发的门冬胰岛素，具有比可溶性人胰岛素吸收快、起效快，低血糖发生率较低等特点。2012年调研数据显示，其在中国16个城市样本医院的销售额已近3亿元人民币，同比上一年增长了22.30％。研究目的：构建3种胰岛素原类似物Insulin Aspart的毕赤酵母表达系统，分别含有短C肽AAK、EWK、MWK，即pPICZαA-IAsp（AAK）/x-33、pPICZαA-IAsp（EWK）/x-33、pPICZαA-IAsp（MWK）/x-33。考察含不同短C肽门冬胰岛素前体在重组菌株中的表达量，通过发酵工艺的研究和比较，筛选高效分泌表达门冬胰岛素的重组工程菌并建立Insulin Aspart的制备、纯化及酶切的中试生产工艺。 研究方法：SacⅠ酶切线性化已构建的重组质粒 pPICZαA-IAsp（AAK）、pPICZαA-IAsp（EWK）、pPICZαA-IAsp（MWK），电转化方法转化感受态毕赤酵母菌株x-33。利用Zeocin浓度不同的固体培养基筛选获得多拷贝重组工程菌pPICZαA-IAsp（AAK）/x-33、pPICZαA-IAsp（EWK）/x-33、pPICZαA-IAsp（MWK）/x-33。分别摇瓶表达IAsp前体并筛选高表达菌株，进行发酵工艺的研究。发酵液经固定金属离子亲和色谱、离子交换色谱纯化后，Zn2+沉淀后复溶。按Lys-c酶/IAsp质量比1：400，4℃酶切过夜后回收切除C肽的门冬胰岛素前体，偶联叔丁醚苏氨酸叔丁酯后脱保护纯化制得门冬胰岛素。 研究结果：成功构建表达含有不同短 C肽门冬胰岛素毕赤酵母重组菌株，pPICZαA-IAsp（EWK）/x-33菌株的表达量最高，经64hr诱导可达2.55g/L。纯化后门冬胰岛素前体经酶切后回收，通过15% Tricine SDS-PAGE、质谱和肽图分析出Insulin Aspart的分子量与理论分子量相符，偶联叔丁醚苏氨酸丁酯后脱保护纯化制得门冬胰岛素。 结论：本研究实现了含短C肽的胰岛素原类似物Insulin Aspart在毕赤酵母中的高效分泌表达，确定表达量较高的为EWK作为短C肽序列的重组菌株。经发酵诱导后，最高表达量2.5g/L；建立了回收率较高成本较低操作简便的纯化工艺，所获终产品经质谱、肽图鉴定正确。此外对酶切方法进行改进，为今后工业化制备提供了基础研究。