【摘 要】
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莱茵衣藻是一种单细胞真核绿藻,近年来,其分子遗传学的研究取得了大量创新性的研究成果,且转化系统已经成熟,是一个受到广泛重视的进行遗传研究的模式生物。人工微RNA技术具有特异性高、效率高等优点,是植物中进行基因功能研究的良好工具。本研究采用人工微RNA技术,以衣藻内源的miRNA为骨架,设计衣藻人工微RNA,旨在利用人工微RNA技术,对莱茵衣藻FAT1和DLD2基因功能进行解析,探寻其编码的产物是否
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莱茵衣藻是一种单细胞真核绿藻,近年来,其分子遗传学的研究取得了大量创新性的研究成果,且转化系统已经成熟,是一个受到广泛重视的进行遗传研究的模式生物。人工微RNA技术具有特异性高、效率高等优点,是植物中进行基因功能研究的良好工具。本研究采用人工微RNA技术,以衣藻内源的miRNA为骨架,设计衣藻人工微RNA,旨在利用人工微RNA技术,对莱茵衣藻FAT1和DLD2基因功能进行解析,探寻其编码的产物是否为脂合成过程中的关键酶。传统的amiRNA表达载体构建方法费用高、操作繁琐,本研究中采用的基于一步法反扩和接合辅助的遗传整合克隆（mating-assisted genetically integrated cloning, MAGIC）的amiRNA表达载体构建方法具有高效、操作简单、成本低、高通量等优点。主要研究结果如下：（1）构建了用于产生amiRNA表达单元的供体骨架载体pRTK-gfp和用于将amiRNA表达单元整合到衣藻基因组的受体骨架载体pmiR1162-gfp;（2）采用基于一步法反扩和MAGIC的amiRNA表达载体构建方法构建了特异性针对FAT1和DLD2基因的amiRNA表达载体pmiR1162-FAT1和pmiR1162-DLD2;（3）通过玻璃珠法分别将amiRNA表达载体pmiR1162-FAT1和pmiR1162-DLD2转化莱茵衣藻CC-425细胞,PCR验证转基因衣藻的阳性克隆率为85%；（4）荧光定量PCR检测结果显示转基因衣藻中FAT1和DLD2基因的相对转录水平降低了60-85%；（5） Nile red染色法结果显示FAT1基因的沉默对衣藻中中性脂含量降低的效果比较明显,而DLD2基因的沉默对衣藻中性脂含量影响不大。
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