【摘 要】
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白介素-33(IL-33)是白介素-1(IL-1)细胞因子家族的新成员,与IL-1α一样都具有双重功能。即一方面可以作为细胞因子被分泌至细胞外,通过配体受体结合的方式发挥作用(IL-33/ST2
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白介素-33(IL-33)是白介素-1(IL-1)细胞因子家族的新成员,与IL-1α一样都具有双重功能。即一方面可以作为细胞因子被分泌至细胞外,通过配体受体结合的方式发挥作用(IL-33/ST2经典途径);另一方面可以作为核因子在细胞核内发挥调节基因转录的作用(核因子途径),但具体作用及其机制不甚清楚。有研究发现,IL-33在细胞核内通过与p65形成转录复合体或直接结合p65的启动子区来参与炎症反应的调控。IL-33在支气管哮喘发生发展中发挥重要作用,启动并维持Th2炎症反应,但其核因子功能是否参与哮喘气道炎症的调控尚不清楚。基于IL-33核因子作用的重要性,本课题旨在深入探讨IL-33具体的核因子功能,主要是研究IL-33对其下游靶基因的转录调控。近年来研究发现泛素/去泛素化修饰对基因转录的调控也发挥重要作用,因此本课题拟探究泛素/去泛素化修饰对IL-33核因子功能的调控。通过PEI(聚乙烯亚胺)转染的方式在HEK293T细胞(人胚肾上皮细胞系)中过表达带His标签的泛素(His-ubiquitin)和Flag标签的IL-33(Flag-IL-33),进一步运用Ni-NTA镍螯合树脂纯化这一方法检测IL-33的泛素化修饰,结果发现IL-33确实存在泛素化修饰;同时,Myc-IL-33和Flag-ubiquitin转染HEK293T细胞,免疫共沉淀发现IL-33与泛素存在相互作用;在HEK293T细胞中过表达Flag-IL-33和多个Myc标签的去泛素化酶(DUB,主要为USP家族),运用免疫共沉淀的方法筛选IL-33的去泛素化酶,结果发现去泛素化酶USP17和USP21(泛素特异蛋白酶17和21)都能与IL-33相互作用;体外过表达IL-33、USP17和USP21,通过核质分离和免疫荧光实验检测三者的亚细胞定位,结果发现三者共定位于细胞质和细胞核;通过Ni-NTA镍螯合树脂纯化检测USP17和USP21对IL-33泛素化修饰的影响,结果发现USP17和USP21都能介导IL-33的去泛素化,它们的酶活突变体USP17 C89S和USP21C221A去泛素化IL-33的能力下降,而且USP17对IL-33的去泛素化能力更为显著;进一步实验发现,USP17能针对泛素第48位和63位赖氨酸相关的泛素化来介导IL-33的去泛素化;在HEK293T细胞中过表达Flag-IL-33和Myc-USP17或Myc-USP17C89S,使用CHX(环己酰亚胺)处理不同时间(0h、4h、8h、12h),通过免疫印迹检测IL-33的蛋白水平,结果发现USP17能稳定IL-33的蛋白水平,而USP17酶活突变体C89S不能有效稳定IL-33的蛋白水平;同样地,USP21也能稳定IL-33的蛋白水平。在TAP-IL-33稳转株细胞中,通过实时荧光定量PCR的方法探索IL-33的下游靶点,结果发现IL-13的m RNA水平升高;比对不同种属(人、家鼠、狗、牛)的IL13基因组序列,发现在IL13翻译起始点前有一段约300bp大小的同源非编码序列(CNS),进一步运用染色质免疫共沉淀的方法检测IL-33是否会结合这段序列,结果发现IL-33能直接结合IL13基因座位上的CNS,而且USP17能下调IL-33对IL13CNS的结合,USP17酶活突变体恰能在逆转这一下调。总之,我们的研究发现了IL-33作为核因子的一个新的下游靶基因,即IL-33能结合IL13基因座位上的CNS,并促进其转录;去泛素化酶USP17和USP21能对IL-33进行去泛素化修饰,这种修饰不仅影响IL-33的稳定性,还能调控IL-33对IL13 CNS的结合,即调控IL-33的核因子功能。IL-13是支气管哮喘发生发展所必需的的细胞因子,我们的研究表明IL-33可直接调控IL-13,这一发现为哮喘免疫学发病机制提供了理论创新,同时拓展了人们对IL-33核因子功能和泛素/去泛素化修饰调控基因转录的认识。
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