论文部分内容阅读
蛋白磷酸化是一种重要的翻译后修饰，在细胞内几乎调控细胞信号转导的各个方面。作为蛋白磷酸化的重要调控因子，MAPK激酶家族中ERK的激活，是细胞对多种外界刺激响应的信号枢纽。在一定的外界刺激下，ERK活性中心的Thr202和Tyr204两个位点被磷酸化，随之ERK的活力显著增高。研究表明在特定的细胞进程中，一些磷酸酶如PP2A，HePTP和MKP3可以通过负调控Thr202和Tyr204这两个位点的去磷酸化下调ERK的活力，从而维持ERK在细胞内参与的各种生理活动，如调控细胞周期、细胞凋亡、分化、增殖等。做为磷酸酶家族成员的一大类，拥有16个成员的PPM家族的磷酸酶是否直接去磷酸化ERK还不是很清楚。已有的研究表明，PPM1A在酵母中负调控MAPK信号通路，并且在体外实验中PPM1A表现出对哺乳动物细胞中ERK较好的活性。因此，在细胞水平阐明PPM1A是否通过去磷酸化ERK调控信号转导，以及在生化上阐明PPM1A对ERK催化的分子机制，具有重要的意义。 在本项研究中，我们报道了在EGF刺激早期，PPM1A可以通过直接去磷酸化ERK的pT202位点负调控ERK的活力，PPM1A可以和ERK形成复合物。酶动力学研究表明存在关键的残基参与PPM1A识别phospho-ERK。与已知的一些PPM1A其他蛋白底物衍生出的磷酸短肽相比，我们发现PPM1A对phospho-ERK短肽序列有相对更好的催化活性。PPM1A活性中心的碱性氨基酸和ERK的pT-E-pY基序相互作用。PPM1A的Lys165和Arg33是催化效率和磷酸底物结合必须的位点，同时Gln185和Arg186决定PPM1A识别底物的特异性。PPM1A的Arg186和phospho-ERK的pY204残基的相互作用认为是PPM1A/phospho-ERK相互作用的一个热点。综上所述，我们的研究证明了PPM1A在EGF引起的信号转导过程中通过去磷酸化ERK的Thr202和Tyr204两个位点负调控ERK活力，生化实验发现了PPM1A底物特异性和识别ERK蛋白底物的决定性位点。