脊椎动物精子发生是一个复杂的过程,睾丸精原细胞要经历有丝分裂、减数分裂,最终分化并发育为精子。睾丸由许多曲精小管及间质组成,每一曲精小管又由各级生精细胞和唯一的上皮细胞一支持细胞(又称哺育细胞)组成。在生精过程中,支持细胞发挥着重要的调节作用。研究支持细胞与生精细胞之间的交互联系,对于理解睾丸组织结构和支持细胞与生精细胞间生理学关系至关重要。在低等脊椎动物中阐明这类细胞间的关系有助于从进化和发育的角度探究支持细胞与生精细胞间的相互关系。目前,对于支持细胞的细胞学研究主要在哺乳动物中,非哺乳类的研究较少。中华鳖是分布于我国和亚洲其它国家的一类古老的爬行动物,可作为食用,是爬行类养殖规模最大的动物,具有极高的经济和药用价值。尽管爬行动物睾丸支持细胞的研究已有一些报道,但是其大部分的结构与功能仍不清楚。少有文献报道爬行类动物相邻支持细胞之间以及支持细胞和生精细胞之间的连接复合体,在龟鳖类物种中则更为罕见。另一方面,爬行动物睾丸的某些功能需要进一步明确。季节性生殖动物中,支持细胞经历脂质循环,但是,在整个生精过程中支持细胞中的脂质的利用却不清楚。排精后,支持细胞可以吞噬残余体或者是残余的精子,但具体的机制仍不清楚。本文揭示了中华鳖睾丸支持细胞在生殖过程中形态学的季节性变化特点,随后,进一步研究支持细胞在生精细胞发育中的作用,并解析生精过程中生精细胞的发育策略。重要的是,本文首次在睾丸支持细胞中探究脂滴自噬在脂滴分解中的作用;揭示生精过程中支持细胞之间的紧密连接和缝隙连接的特点。本研究阐释了支持细胞的一个新异的细胞学机制,即在冬眠期,支持细胞可以通过内化和自噬途径清除睾丸曲精小管中残余的精子,这对于中华鳖睾丸下一次生殖周期的进行必不可少。综上所述,本文详细研究了支持细胞超微结构,并且发现了支持细胞对生精细胞发育的全新功能;在细胞水平上首次发现支持细胞的脂滴自噬和内化作用。试验Ⅰ生殖周期中中华鳖支持细胞及其与生精细胞的联系支持细胞在睾丸生精细胞的发育过程中发挥着重要的作用,在整个生精过程中表现出不同的形态特征。应用光学显微镜、透射电镜和免疫组织化学法观察了中华鳖生殖周期中睾丸支持细胞的形态变化特点。在生精过程停止的冬眠期,支持细胞中发现了自噬小体。生精早期,生精细胞开始增殖,支持细胞中含有许多的脂滴。生精晚期,支持细胞变得狭长并包绕着若干圆形或细长的精子细胞。同时,支持细胞胞质中出现大量的内质网和线粒体。支持细胞和生精细胞之间的紧密连接和黏着连接随着生殖周期而发生变化。生精过程中支持细胞常与胞质桥的形成、吞噬泡(自噬体前膜)以及外泌体形成有关。支持细胞也与排精时期围绕在精子细胞头部管状小叶复合体的形成有关。与冬眠期和生精早期相比,在生精后期波形蛋白显著分布于支持细胞。研究结果阐明了支持细胞在雄性中华鳖生殖周期性中变化规律。试验Ⅱ中华鳖睾丸支持细胞间紧密连接和缝隙连接的特性研究精子发生过程中,早期发育中的生精细胞必须由曲精小管基底部到达管腔处,这与连接复合体的大量重建相关。然而关于爬行动物中这些连接复合体却鲜有报道。本试验观察了中华鳖睾丸支持细胞之间紧密连接蛋白(CLDN11)和缝隙连接蛋白(Cx43)在生精过程中的表达规律。生精早期,CLDN11免疫阳性反应较弱,Cx43在支持细胞管腔部位点状分布而在靠近基底部位则较少。生精晚期,CLDN11和Cx43在支持细胞连接处以及初级精母细胞靠近支持细胞基底部位处广泛分布。在晚期,CLDN11和Cx43蛋白表达显著下降,仅仅分布于支持细胞周围以及精母细胞基底部。透射电镜显示,在精子发生的中期支持细胞之间的紧密连接位于支持细胞的基底部位。而缝隙连接在整个生精过程中位于支持细胞之间、支持细胞与精原细胞和初级精母细胞之间。在生精过程中也观察到了黏着连接和半桥粒。上述结果表明,紧密连接和缝隙连接随着生精时期的不同而发生相应变化,这可能与生精细胞的发育分化有关。试验Ⅲ生精过程中中华鳖支持细胞脂滴自噬的细胞学研究精子的产生是一个复杂的过程,支持细胞内脂滴的形成对于维持正常的生精是必不可少的。但是,其内部脂滴的利用过程却不清楚。中华鳖睾丸精原细胞在5月份开始增殖,减数分离期主要在7月,10月份曲精小管中分布大量的生精细胞。透射电镜和油红O染色表明5月份支持细胞中分布有大量的脂滴。有些脂滴附着到分离膜上面,表明脂滴可能是自噬小体生成的内生性能量来源之一。5月份脂滴被包裹在自噬小体内,然而10月份支持细胞中自噬小体和线粒体可直接与脂滴接触。免疫组织化学表明,支持细胞中LC3的表达在5月份强于10月份。本试验首次表明支持细胞中脂滴自噬对脂滴积累的两种不同作用方式,这是生精过程中支持细胞和生精细胞联系的关键方面。试验Ⅳ内化作为一种新途径参与睾丸支持细胞的精子清除本试验在体研究发现冬眠期中华鳖睾丸曲精小管中残余的精子可以被内化途径清除。Western blot表明冬眠期LAMP 1的蛋白表达水平比非冬眠期显著升高。免疫组织化学法发现LAMP 1阳性表达主要分布于睾丸支持细胞。透射电镜进一步发现,支持细胞中许多被降解的精子包绕在大的内吞泡内。有些精子的细胞核和鞭毛在支持细胞的内吞小体中被降解。有时一个内吞泡内包含了多个精子。值得注意的是,冬眠期支持细胞的内吞泡中含有不同类的自噬小体,包括:初级的自噬膜泡、降解中的自噬小体等。在冬眠末期,支持细胞的内吞小泡和自噬小体被大量的脂滴替代。支持细胞与生精细胞之间具有粘着连接,而此结构是支持细胞内吞途径的结构基础。结果表明:1、冬眠期在体细胞可以发生内化现象,且自噬协助内化物质的降解;2、作为高度分化的细胞—精子可以被支持细胞内化降解,这有利于雄性中华鳖下一个生殖周期的正常运转。