油炸薯片中产生的丙烯酰胺免疫分析方法的建立

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油炸薯片口感松脆,口味多变,越来越受到人们的欢迎,尤其是青少年和儿童。这些富含淀粉的油炸食品在加工过程中往往会产生一些小分子物质,如丙烯酰胺,其含量会随着温度的升高而增加。研究表明,丙烯酰胺具有致癌性、遗传毒性、神经和生殖发育毒性,长期摄入会影响人们的身体健康。因此本文将油炸薯片中产生的丙烯酰胺作为目标检测物,研究建立快速、高灵敏的免疫检测方法,该方法检测时间短,能提高检测效率,满足丙烯酰胺的日常检测需求。本文主要基于标记免疫分析技术,建立快速检测油炸薯片中丙烯酰胺的方法,主要研究内容如下:(1)半抗原的合成和抗体的制备:分别合成了3种化合物作为丙烯酰胺的半抗原,通过载体蛋白偶联制备免疫原进行动物免疫得到3种丙烯酰胺多克隆抗体。基于间接酶联免疫分析法,在同源和异源包被条件下分别对免疫得到的抗血清进行优化测定,结果可知在同源包被条件下,通过免疫原AA-4-MBA-BSA得到的抗血清效价和抑制率最高,对该抗血清进行纯化,得到亲和力高的丙烯酰胺多克隆抗体,选择该抗体用于后续的免疫分析实验。(2)酶联免疫分析方法的建立:采用棋盘滴定法确定最佳抗体稀释倍数及包被原浓度,通过单因素实验优化检测条件,确定最佳包被条件是4℃同源包被12 h,最佳的封闭液和抗原稀释液分别为1%BSA/PBS和10%甲醇PBS溶液(pH=7.4),最佳的抗原抗体竞争反应时间为45 min。在此反应条件下,采用间接竞争酶联免疫分析法检测丙烯酰胺半抗原,检测灵敏度(IC50)为55μg/L,检出限(IC15)为2μg/L。根据衍生率推算薯片中丙烯酰胺的含量,通过HPLC对检测结果进行验证可知该方法能实现对薯片中丙烯酰胺的有效检测。(3)荧光免疫分析方法的建立:通过水热法合成碳量子点,然后与丙烯酰胺特异性抗体偶联成荧光探针,并通过紫外光谱扫描、荧光扫描和凝胶电泳法进行表征,建立荧光免疫分析方法。由检测结果可知,当丙烯酰胺半抗原浓度为0.321000μg/L时,标准曲线呈现出良好的线性关系。通过加标、衍生、检测、计算可知,该方法对油炸薯片中的丙烯酰胺回收率为76%89%,与HPLC检测结果具有较好的一致性。与建立的酶联免疫分析方法相比表现出简洁、方便、用时更短且无需底物参与显色的优势。
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