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目的本研究旨在探讨我国传统中药-铁皮石斛,其主要成分-铁皮石斛多糖(Dendrobium officinale polysaccharide,DOP)对骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经样细胞分化的影响,及其对大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠功能预后的作用,以期为脑卒中的治疗提供新策略。方法实验一:新鲜铁皮石斛原球茎经干燥、粉碎后,采用水提醇沉法对其主要成分-铁皮石斛多糖进行提取,应用苯酚-硫酸法对经上述提取的铁皮石斛多糖进行含量测定。实验二:采用密度梯度离心法对提取的骨髓间充质干细胞进行分离、纯化。培养至P3-P4代时,应用流式细胞技术对骨髓间充质干细胞进行鉴定(检测标记物为CD90,CD44,CD34)。将提取的铁皮石斛多糖配制成不同浓度(10,25,50,75,100μg/ml)的铁皮石斛多糖溶液,与P3-P4代骨髓间充质干细胞共培养7天,同时设置对照组;通过RT-PCR(real time-polymerase chain reaction)检测神经分化相关标记物nestin,MAP2,VEGF-A mRNA在各组中的表达水平并筛选出最佳浓度;应用Western blot检测神经分化相关标记物Enolase,Thy-1,β-tubullinⅢ在各组中的表达情况,应用免疫荧光染色技术检测神经分化相关标记物CD24,Thy-1在各组中的表达情况,以评价铁皮石斛多糖对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响。实验三:80只雄性SD大鼠随机分为假手术组、MCAO模型组、BMSCs组、神经样细胞组。MCAO建模后24h,给予神经样细胞组病灶侧侧脑室定点注射经铁皮石斛多糖诱导后的神经样细胞,BMSCs组给予等量的BMSCs,MCAO组及假手术组给予等量的生理盐水。分别在注射后的第1,4,7,14天对比各组大鼠改良神经系统严重程度评分(modified Neurologic Severity Scores,m NSS);第14天,应用脑组织TTC染色、ELISA法分别对比各组大鼠脑梗死体积和血清炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的水平。结果实验一:经检测,铁皮石斛内物质的提取率为17.04%,提取物中多糖含量为89%。实验二:(1)大鼠BMSCs表面CD90的表达率为96.79%,CD44的表达率98.27%,CD34的表达率2.64%,证实所提取的细胞即BMSCs。(2)不同浓度铁皮石斛多糖(10,25,50,75,100μg/ml)组nestin mRNA的表达水平均显著高于对照组(阴性对照组、阳性对照组);不同浓度组间比较,其中25μg/ml组nestin mRNA表达水平显著高于10,50,75,100μg/ml组。mRNA(MAP2,VEGF-A)表达趋势与nestin mRNA的表达一致。这表明铁皮石斛多糖具有增强BMSCs向神经样细胞分化的作用,并且25μg/ml是最佳浓度。后续实验即以最佳浓度25μg/ml开展。(3)Western blot和荧光染色结果显示Enolase,Thy-1,β-tubullinⅢ,CD24在阴性对照组、阳性对照组、铁皮石斛多糖组均呈现依次递增趋势。实验三:m NSS结果显示神经样细胞组在定点注射后第4,7,14天均较MCAO模型组明显减少,第14天时,神经样细胞组m NSS明显小于BMSCs组。TTC染色结果显示MCAO模型建立后,脑梗死体积明显增加,定点注射后,BMSCs组和神经样细胞组脑梗死体积均较MCAO模型组明显减小,且神经样细胞组脑梗死体积显著小于BMSCs组。ELISA结果显示MCAO模型建立后,三种炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的表达水平均升高,定点注射后,BMSCs组和神经样细胞组三种炎症因子的表达均较MCAO模型组显著降低,且神经样细胞组三种炎症因子的水平均明显低于BMSCs组。结论1.铁皮石斛多糖对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化具有促进作用,且最佳的作用浓度为25μg/ml。2.经铁皮石斛多糖诱导后的神经样细胞对脑缺血-再灌注损伤大鼠的神经功能恢复具有促进作用,机制可能与降低模型鼠体内炎症因子的表达有关。