背景：衰老(senescence)又称老化,是整个机体形态结构和生理机能的全面衰退,是一个动态的、复杂的过程。当前预防和延缓衰老已成为生命科学研究的热点。有关衰老机制的研究一直是生物学、老年医学研究的前沿课题。对其机制的研究中有自由基学说、代谢学说、免疫系统退化学说、端粒酶变化等多种学说,但没有一种学说能完整解释衰老的机制。原林教授提出的“筋膜学说”认为：人体由两部分组成,一个是由尚未分化的非特异性结缔组织(筋膜)支架所构成的支持与储备系统,一个是以已分化的功能细胞为基础的功能系统。功能系统在支持与储备系统支持下维持结构与功能的稳定,而支持与储备系统源源不断的为功能系统的细胞更新和功能活动提供细胞供应和营养物质。功能系统是以功能细胞的专能特化为基础的,而支持与储备系统的筋膜支架以干细胞为核心,通过分化出各种定向干细胞,为功能系统的更新提供源源不断的细胞补充,并为功能系统的各种细胞的更新、代谢提供一个稳定的内部环境。即衰老是筋膜中干细胞储备逐渐耗竭的过程,而如何保持筋膜的正常状态,从而为功能系统提供稳定的细胞来源并维持其向功能细胞的正常分化,是延长生命周期的关键。如果衰老时减少的干细胞能得到及时的补充,为机体提供新的细胞储备,可修复机体损伤,延缓衰老、延长生命周期。不同于其他的衰老学说,筋膜学说从另一个不同的角度——发育生物学——对衰老提出了新的认识,同时与从微观角度提出的各种衰老学说并无矛盾,认为各种微观角度的改变最终导致的结果都是筋膜组织—支持与储备系统功能的减退。间充质干细胞(menchymal stem cells)具有自我更新、多向分化的能力。最初是由Friendenstein等发现,而且证明其在体外可以分化成为成骨细胞及脂肪细胞,而后其它的研究小组发现骨髓来源的MSCs不仅可以分化为中胚层来源的组织,而且可以分化为内胚层和外胚层来源的组织。而且间充质干细胞的多组织来源与筋膜结缔组织支架的全身分布是一致的,其纵向、横向分化的生物学特性与筋膜学提出的筋膜结缔组织对机体的支持储备作用也是一致的。脂肪源干细胞(ADSCs)是筋膜中未分化干细胞的一种储备形式。ADSCs具有多向分化潜能,能够跨胚层分化。它可以分化成中胚层来源的脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞；外胚层来源的神经细胞；也可以分化成内胚层来源的内皮细胞及肝细胞等。ADSCs具有低免疫原性,免疫调节功能和分泌细胞因子等能力,为异体移植提供了有利条件,使ADSCs成为生物治疗的亮点之一；ADSCs分泌细胞因子抗老化的作用,已经被临床广泛应用。ADSCs不仅可以用来进行各种退行性和衰竭疑难病的替代治疗,而且可用来进行辅助的免疫治疗。脂肪源干细胞可以调节受损组织局部微环境,可以分泌一系列细胞因子和生长因子到周围组织液中,调节组织微环境,形成有利于干细胞生长的微环境--“干细胞巢”--招募来自于受体的内源性干细胞到达靶点,并使其向所需要的特定组织细胞定向分化。脂肪干细胞本身能够耐受缺氧,同时在缺氧的环境中还能释放抗氧化物质、自由基清除剂、分子伴侣、热休克蛋白等,清除受损局部的细胞毒性物质,促进尚存活的细胞复苏,在脂肪移植后形成有利于组织细胞存活和功能维持的微环境。ADSC还有可能通过旁分泌细胞因子促进组织修复。经静脉注射的ADSC可自主聚集于病灶部位参与修复损伤。ADSC的这种“归巢”作用,其具体机制不明。有报道称通过增加膜型基质金属蛋白酶1(membranetype1matrix metallop roteinase, MT1-MMP)表达和促进MMP-2酶原的激活可增强ADSCs的迁移。近期研究发现,ADSC能释放新的线粒体至损害的细胞,从而挽救有氧代谢的过程。这说明ADSC可通过多种机制参与组织的修复。简言之,ADSCs可能通过以下机制修复或者重建组织：首先,ADSCs被植入一个受损的或是坏死的组织,它们能以副分泌的方式分泌出细胞活素和生长因子以刺激修复。ADSCs可以提供抗氧化剂、自由基清除剂、热休克蛋白等给待修复组织,从而清除局部环境中所释放的有毒物质,促进仍存活的细胞的修复。另外,ADSCs可以通过刺激内生性干细胞补充到待修复的脏器或自身直接迁移补充到待修复区域,以调节干细胞的微环境,并且促进它们沿着需要的方式分化为功能细胞,从而更新机体衰老的功能细胞,维持机体平衡。D-gal所致亚急性衰老模型是国内外比较公认的衰老模型。在一定时间内连续给动物注射D-半乳糖使机体细胞糖代谢及脂代谢紊乱,体内糖浓度增高后被醛糖还原酶催化还原成半乳糖醇,其不能被细胞进一步代谢而堆积体内、影响正常渗透压,导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱,不仅破坏并消耗机体抗氧化防御系统,使自由基积聚；同时在半乳糖还原成半乳糖醇的过程中又使细胞膜脂质受损,过氧化脂质、脂褐素增高,出现衰老。糖代谢紊乱必然会引起心、肝、肾、脑等重要器官代谢异常,最后出现衰老。D-半乳糖模型因全面影响细胞的代谢功能和一些重要的酶的功能,所导致的老化较全面。其老化与机能减退的具体机制可能与代谢障碍、免疫损伤、自由基损伤及线粒体损伤等相关。目前,该模型已广泛应用于研究衰老机制以及延缓衰老药物的筛选。D-gal致亚急性衰老模型可以模拟脑、肝脏、肾脏、皮肤、性腺轴、骨质疏松、免疫系统等多脏器的损伤。文献报道可应用干细胞移植治疗,亦有文献报道应用中药提取物、中药汤方、激素及针灸等多种方法治疗此模型造成的衰老。雄激素可提高性中枢神经系统的兴奋性,诱发性欲冲动,从而维持正常的性机能。睾丸间质细胞(Leydig cells)是机体分泌睾酮的主要细胞,分泌量约占身体总睾酮的95%；国际上对男性生殖疾病治疗的研究也多集中在Leydig细胞的培养和移植上。睾丸间质细胞具有合成、分泌睾酮的特点。睾酮合成过程中,17β-HSD3、3p-HSD1催化脱氢异雄酮形成睾酮。而3β-HSD是合成睾酮的关键酶,成年大鼠睾丸中只有间质细胞表达3β-HSD,所以目前对间质细胞的鉴定一般都采用3β-HSD特异性染色方法。Percoll梯度浓度分离的Leydig细胞量大、纯度较高、细胞活力良好,初步解决了组织工程技术构建雄激素分泌组织的种子细胞来源的问题。用该方法获得的Leydig细胞所构建的组织工程化雄激素分泌组织能在较长时期维持睾酮分泌功能。为探讨外源性脂肪源干细胞移植是否具有延缓衰老的作用及其作用机制,本实验体内观察移植外源性ADSCs对D-半乳糖(D-gal)衰老大鼠自由基及免疫等衰老指标,以及对衰老大鼠性能力的改善等方面的影响；体外观察脂肪源干细胞基质与D-gal处理的睾丸间质细胞(LCs)共培养,探讨ADSCs对Leydig cell的保护性作用,探索一种新的抗衰老机理,为临床延缓衰老的治疗提供新的思路和方法。目的研究移植脂肪源干细胞对D-半乳糖致衰老大鼠相关衰老指标以及交配能力的影响,探讨临床替代疗法的治疗机理,进一步为筋膜结缔组织是干细胞的储备源泉提供证据支持,为筋膜学提供理论支撑。1、检验非特异性筋膜结缔组织中是否存在脂肪源干细胞。2、观察移植脂肪源干细胞能否对D-半乳糖衰老大鼠的血清、自由基及免疫功能产生影响,阐述移植脂肪源干细胞对抗D-半乳糖衰老的血清学意义。3、通过观察交配实验,研究移植筋膜结缔组织中的脂肪源干细胞能否提高D-半乳糖致衰老大鼠的性能力；通过免疫组织化学染色,观察移植标记的脂肪源干细胞在睾丸组织中的定位和移位情况,及睾丸间质细胞分泌3p-HSD、17β-HSD的情况；通过免疫组织化学染色,观察睾丸间质细胞细胞形态学变化及其凋亡状况；通过血清学检测,观察睾酮分泌状况。4、体外分离培养睾丸间质细胞,观察脂肪干细胞对D-gal处理的睾丸间质细胞的保护性作用,为“筋膜学”抗衰老相关理论提供进一步佐证。方法1、取成年SD大鼠腹股沟脂肪垫,用酶消化法分离、培养筋膜结缔组织的脂肪源干细胞。通过用形态学、功能学、流式细胞术鉴定非特异性筋膜结缔组织源细胞是否符合间充质干细胞的特性,进而判断非特异性筋膜结缔组织中是否含有间充质干细胞。2、体外Percoll分离液梯度分离培养睾丸间质细胞,并通过形态学及3β-HSD特异性染色鉴定；以0、4、8、12、16g/L不同浓度的D-gal处理睾丸间质细胞,每个浓度做三个复孔,每个孔重复三次。24h后,计算细胞存活率,筛选最适浓度模拟细胞衰老模型；另流式细胞仪检测8g/LD-半乳糖处理Leydig cell在0、24、48、72h不同时间点的细胞周期变化。3、体外分离培养4代ADSCs,取上清制备脂肪干细胞基质(ADSC-CM);8g/LD-半乳糖处理Leydig cell,同时与ADSC-CM共培养24h后,MTT检测其细胞活性；流式细胞仪检测各组细胞共培养24h的周期变化；共培养48h,SA-p-半乳糖酐酶染色,每组取4个视野,每个视野至少100个细胞。检测细胞衰老情况；免疫组化观察3p-HSD分泌情况。4、30只SD大鼠随机分成空白对照组(A组)、模型组(B组)和治疗组(C组),每组10只。B、C组颈背部皮下注射15%D-半乳糖1000mg/(kg-d),连续8周复制亚急性衰老模型,A组的大鼠每天给予生理盐水1.6ml颈背部皮下注射。5、模拟衰老模型成功后,治疗组内的大鼠进行脂肪源干细胞静脉移植：移植的第3代ADSCs在进行传代后,在培养基中掺入10μmol/L的Brdu,孵育3天后消化收集,无菌生理盐水重悬,制成300万/ml；同样每只大鼠经尾静脉注射ADSCs3×106个,模型组输入生理盐水1ml。6、交配实验的雌鼠分别在实验前48h和4h采用皮下注射苯甲酸雌二醇200μg/kg和黄体酮2mg/kg用来诱导雌鼠发情,用发情的雌鼠和雄鼠进行交配,从而对雄性进行相关性能力研究。HE染色显示大鼠睾丸组织精曲小管结构变化,采用免疫组化及免疫荧光追踪移植细胞；免疫组化观察3β-HSD1、17β-HSD3分泌情况,TUNEL免疫组化染色观察大鼠间质细胞凋亡指数。放射免疫法观察大鼠血清睾酮含量。7、采用SPSS13.0统计软件处理,以均数±标准差(x±s)表示,方差齐时,多样本均数比较均采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法；方差不齐时,多样本均数比较均采用Welch法,两两比较采用Dunnett’s T3方法,P<0.05表示有统计学差异。结果1、腹股沟皮下筋膜结缔组织内的脂肪源干细胞具有长梭形、多角形的形态学特征,可形成细胞集落,体外可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞。2、体外Percoll分离法可成功分离培养睾丸间质细胞。间质细胞呈多边形、三角形。单层贴壁生长,伸展后呈漩涡状排列,细胞以集落形式增殖；经3p-HSD特异性染色鉴定,镜下可见睾丸间质细胞被染成蓝黑色而其他睾丸细胞不着色,睾丸间质细胞纯度可达到95%以上；MTT法显示8g/L的D-gal模拟衰老模型细胞存活率为(81.96±0.96),为最适浓度,可成功诱导leydig cell老化(F=8960.772,P=0.000)；且随时间延长,8g/L的D-gal处理的LCs呈现G0/G1期细胞增多,S期细胞减少。3、ADSCs上清中可以提取出ADSCs-CM。空白对照组、8g/LD-gal处理的Leydig cells组、8g/LD-gal处理的Leydig cells与ADSCs-CM共培养组做比较,三组之间差异有统计学意义(F=1101.980,P<0.001)。MTT检测显示其细胞活性有所提高(P<0.001)；流式细胞仪共培养24h后,细胞周期中G0/G1期细胞比例下降；空白对照组、8g/LD-gal处理的Leydig cells组、共培养组之间的SA-β-半乳糖酐酶阳性细胞数差异有统计学意义(F=1105.307,P<0.001)；共培养48h, SA-β-半乳糖酐酶染色,共培养组SA-β-半乳糖酐酶阳性细胞减少(P<0.001),细胞衰老减轻；免疫组化观察共培养后细胞分泌的3β-HSD分泌情况增加。4、连续皮下注射D-gal可以模拟大鼠衰老。空白对照组、D-gal处理组、ADSCs-移植组之间的CuZn-SOD (F=28.587, P<0.001)、NO水平(F=56.571,P<0.001)、血清IL-2水平(F=23.667,P<0.001)、脾脏指数(F=33.830,P<0.001)和胸腺指数(F=15.847, P<0.001)、MDA水平(F=45.468,P<0.001)差异有统计学意义。衰老模型组与空白对照组比较,血清MDA水平有所升高(P<0.001),血清CuZn-SOD(P<0.001)、血清NO(P<0.001、IL-2水平(P<0.001)以及脾脏指数(P<0.001)、胸腺指数(P<0.001)均有所降低,提示D-半乳糖模拟亚急性大鼠衰老模型复制成功。与模型组比较,细胞治疗后衰老大鼠SOD活性(P=0.04)、血清IL-2水平(p=0.038)、血清NO水平(P<0.001)和胸腺指数(P=0.002)、脾脏指数(P=0.001)均有所升高,MDA水平则降低(P<0.001)。5、空白对照组、D-gal模型处理组、ADSCs-移植组之间的血清睾酮含量比较差异有统计学意义(F=25.370,P<0.001),与空白对照组比较,模型组血清睾酮含量有所降低(P<0.001),提示D-半乳糖亚急性大鼠衰老模型已复制成功。与模型组比较,细胞治疗组血清睾酮含量有所升高(P=0.033)。空白对照组、D-gal模型处理组、ADSCs-移植组之间的交配次数比较差异有统计学意义(F=16.280,P<0.001),与空白对照组比较,模型组大鼠交配次数有所减少(P<0.001),提示D-半乳糖亚急性大鼠衰老模型复制成功。经过移植细胞治疗后,与模型组比较,细胞治疗组交配次数有提高(P=0.027)。睾丸间质细胞分泌3β-HSD、17β-HSD增多,而TUNEL染色显示睾丸间质细胞凋亡率降低(P<0.001)。结论1、筋膜结缔组织脂肪源干细胞具有长梭形、多角形的形态学特征,可以形成细胞集落,与其它组织来源间充质干细胞无显著差别；细胞表面标记物检测中,4代贴壁ADSCs的特异性表面标志物CD90.CD29表达率分别为90%以上,而CD49d、CD11b、CD45阴性表达,CD106弱表达；该细胞经定向诱导后可以成骨、成脂肪,与间充质干细胞多向分化的功能一致。由此可以判断在发育成熟大鼠的筋膜结缔组织中存在未分化间充质干细胞。2、通过Percoll梯度离心的方法,可以获取稳定的高纯度的睾丸间质细胞；30-HSD特异性染色,可以对其鉴定。3、中浓度的D-gal诱导细胞衰老,且可以保证细胞存活率。在高浓度环境下(16g/L)及中浓度(8g/L)的长时间作用下,可以诱使睾丸间质细胞凋亡。4、体外脂肪干细胞基质与8g/L D-gal处理的睾丸间质细胞共培养,可以明显防护D-半乳糖对睾丸间质细胞的损害,提高细胞活性,减少衰老细胞数目。促进3p-HSD、17β-HSD的分泌,保护睾丸间质细胞。5、连续颈背部皮下注射D-gal可以有效模拟亚急性衰老模型。衰老大鼠在外观上及自由基等方面,显示显著衰老征象。6、尾静脉移植脂肪源干细胞后,可显著升高衰老大鼠体内SOD含量、IL-2水平,而有效降低MDA含量,同时提高胸腺和脾脏指数。7、移植脂肪源干细胞可以改善衰老老鼠的交配能力,促进睾酮释放,同时保护睾丸间质细胞。综上所述,本研究分别采用了细胞分离培养、诱导分化、动物模型建立、HE染色和免疫组化、免疫荧光等技术手段,从血清学自由基及免疫功能方面,以及交配能力等多方面、多角度的探讨了体内移植外源性脂肪源干细胞对D-gal诱导的亚急性衰老大鼠的作用以及体外ADSCs-CM对D-gal处理的睾丸间质细胞的保护作用。同时,体外ADSCs-CM可以降低D-gal对睾丸间质细胞的毒性作用。本研究发现,补充外源性的脂肪源干细胞可以延缓D-gal诱导的衰老,提高其生命质量；从而为筋膜学的支持与储备理论提供实验支持。