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众所周知,杀虫剂不合理的使用,不但对生态环境造成污染,而且加剧各种害虫在高度选择压力下快速进化而形成抗药性,更为可怕的是这些杀虫剂亦可以通过食物链富集而给人类自身埋下健康隐患。如何在农业发展与生境保护的博弈中找到一个平衡点,已成为当前世界性难题。近年来随着分子生物学以及基因组学的迅猛发展,给昆虫抗药性的分子机制研究带来了新的机遇。当前学术界关于昆虫抗药性成因的主流观点是相关抗性基因扩增、差异表达和结构改变,各国学者也相继报道并克隆验证了一批抗性相关靶标基因。昆虫抗药性形成涉及诸多层面,研究和发现抗药相关的基因对进一步阐明昆虫抗药性的分子机制和制定合理有效的害虫防治措施提供理论依据。本实验室在前期蛋白质双向电泳(2-DE)的工作中发现,Ran能明显响应果蝇Kc细胞耐受溴氰菊酯(DM)刺激,随后经细胞转染技术证实Ran是细胞参与DM抗性形成相关基因,这引发下一个问题:Ran对于杀虫剂的响应是否具有一定代表性和广谱性?目前有关Ran与其他杀虫剂应激关系的研究还未见报道。为了进一步探究Ran与各类杀虫剂应激关系,本文仍以黑腹果蝇Kc细胞为研究对象,采用荧光定量、免疫印迹、细胞转染、RNAi、流式细胞术等多种实验技术为手段,探究Kc细胞在多种杀虫剂(DDT、对硫磷、西维因、多杀菌素)胁迫下Ran的响应情况以及Ran表达水平和细胞耐受杀虫剂胁迫的关系。得到如下主要实验结果:(1)在果蝇Kc细胞中,分别用不同剂量的杀虫剂处理不同时间,经荧光定量检测细胞中Ran的表达量,探索各类杀虫剂最适条件。结果表明,Ran对4种杀虫剂均有不同程度的响应,结果暗示Ran可能在多种杀虫剂耐受形成过程扮演有重要角色。(2)扩增Ran基因ORF序列并外源转染至细胞,经检测转染成功后分别施加DDT和对硫磷胁迫。结果表明,转染重组质粒24 h,细胞中Ran的表达量显著升高。加入杀虫剂胁迫24 h,实验组较之对照组而言,Ran的表达水平较对照上调3.15和2.46倍,结果表明外源添加Ran可以增强细胞对于这两种杀虫剂的耐受水平。(3)制备Ran基因dsRNA并外源转染至细胞,经检测转染成功后分别施加DDT和对硫磷胁迫。实验表明,转染外源dsRNA24h,Ra 表达量显著下调,而经杀虫剂胁迫24 h,Ra 表达水平可逐渐恢复,实验组较之对照组而言,Ran表达较对照分别上调1.61和1.15倍。结果表明,降低Ran表达水平可以降低细胞对于这两种杀虫剂的耐受水平。(4)FCM检测各个处理组细胞凋亡情况,分析Ran在杀虫剂应激中的作用,结果显示,杀虫剂处理剂量在20mg/LDDT和40mg/L对硫磷,Kc细胞凋亡水平达最低。转染重组质粒可明显降低细胞凋亡;与之相反,转染dsRNA实验组凋亡率明显提高。结合20 mg/L DDT和40 mg/L对硫磷为Ran最适响应剂量,我们推测Ran表达水平能在一定程度影响细胞对于杀虫剂的适应于耐受。外源添加Ran可以增强细胞对于这两种杀虫剂的存活率,降低Ran表达水平可以提高细胞对于这两种杀虫剂的凋亡率。上述研究结果表明,上调基因Ran的表达水平可以提高细胞对杀虫剂胁迫的耐受,从而对细胞具有一定的支持和保护作用。综合上述的实验结果,我们认为Ran是一种广泛耐受多种杀虫剂的相关基因,但是相关机理尚需进一步探究。