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[目的]基于RNA测序(RNA-seq)技术,研究化合物GA5克服人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/Adr(Muti-drug Resistance,MDR)耐药性的作用靶点及机制。[方法]以化疗药阿霉素(DOX)诱导的、具有多药耐药特性的人乳腺癌细胞MCF-7/Adr为模型:1、采用MTT 比色法检测GA5单独作用及GA5与化疗药联合作用,对耐药细胞MCF-7/Adr化疗敏感性的影响;2、RNA-Seq技术筛选基因:(1)以MCF-7敏感细胞株为参照,采用RNA-Seq技术筛选MCF-7/Adr的差异性转录基因,以发现可能的耐药相关基因;(2)以MCF-7/Adr耐药细胞为参照,采用RNA-Seq技术筛选化合物GA5作用后MCF-7/Adr细胞的差异性转录基因;(3)从MCF-7/Adr与MCF-7中筛选的差异性转录基因,GA5作用后的MCF-7/Adr与MCF-7/Adr中筛选出的差异性转录基因,找到两组筛选的差异性转录基因中找到共同差异性转录基因,以发现GA5克服耐药可能的干预靶点;3、采用qRT-PCR技术验证基因转录水平,(1)MCF-7与MCF-7/Adr中多药耐药基因的转录水平;(2)MCF-7 与 MCF-7/Adr 中 TENM4、PCDHA12、PLPPR4、HIST1H1B、HFM1、BMP6、ANGPTL4、TLE3、NDRG1、GPR78、CAVIN-2差异性转录基因的变化;(3)GA5作用后的MCF-7/Adr与MCF-7/Adr中TENM4、PCDHA12、PLPPR4、HIST1H1B、HFM1、BMP6、ANGPTL4、TLE3、NDRG1、GPR78、CAVIN-2差异性转录基因的变化。4、采用 Western Blot 验证 MCF-7、MCF-7/Adr 细胞中 BMP6、TLE3、NDRG1蛋白表达的变化及GA5对MCF-7/Adr细胞中BMP6、TLE3、NDRG1蛋白表达的影响。[结果]1、MTT检测结果显示,化疗药多柔比星(Doxorubicin,DOX)、紫杉醇(Paclitaxel,PTX)、顺铂(Cisplatin,DDP)、依托泊苷(Etoposide,VP-16)对 MCF-7 敏感细胞的半数抑制浓度 IC50 分别为 1.47±0.08、2.89±0.50、16.15±0.32、92.85±3.90 μM,在以上受试化疗药物中,除VP-16外,其它3个化疗药均表现出对MCF-7细胞显著的抑制活性。而在同等实验条件下作用于耐药细胞,MCF-7/Adr细胞不仅对DOX产生耐药,对PTX、DDP、VP-16也产生不同程度的耐药。结果表明,MCF-7/Adr细胞对DOX高度耐药、对VP-16明显耐药(但MCF-7不是VP-16的敏感细胞)、对PTX、DDP存在耐药,因此MCF-7/Adr显示出了多药耐药细胞的特性,此模型符合本研究的要求。2、化合物 GA5 对 MCF-7、MCF-7/Adr 细胞的 IC50 分别为 54.94±0.99、13.55±0.28μM,与上述化疗药物相比对MCF-7/Adr具有较强的活性,且与敏感株细胞MCF-7相比GA5对多药耐药细胞MCF-7/Adr的作用具有明显优势,此结果与前期结果相近。GA5对联用不同化疗药物对MCF-7/Adr的影响:(1)GA5与DOX联用对MCF-7/Adr细胞耐药性的影响,结果显示,DOX单用及联用不同浓度化合物GA5对MCF-7/Adr细胞的IC50分别为:234.07±13.55、188.43±57.93、175.90±35.70、142.94±30.21 μM,Rf 分别为:1.24、1.33、1.64 倍,表明化合物GA5能增加耐药细胞MCF-7/Adr对化疗药DOX的敏感性。(2)GA5与PTX联用对MCF-7/Adr细胞耐药性的影响,结果显示,PTX单用及联用不同浓度化合物 GA5 对 MCF-7/Adr 细胞的 IC50 分别为:2.88±0.88、1.67±0.15、1.99±0.47、2.44±0.25 μM,Rf 分别为:1.72、1.44、1.18 倍,低浓度 GA5 在 MCF-7/Adr细胞显示出一定的对PTX耐药的逆转效应,但未显示出量效关系。(3)GA5与DDP联用对MCF-7/Adr细胞耐药性的影响,结果显示,DDP单用及联用不同浓度化合物 GA5 对 MCF-7/Adr 细胞的 IC50 分别为 18.71±1.99、16.23±4.78、20.47±6.54、19.25±4.03 μM,表明 GA5 在 MCF-7/Adr 细胞未显示出对 DDP 耐药的逆转效应。(4)GA5与VP-16联用对MCF-7/Adr细胞耐药性的影响,结果显示,VP-16单用及联用不同浓度化合物GA5对MCF-7/Adr细胞的IC50分别为:460.7±58.55、279.23±100.00、328.00±124.00、271.25±21.00μM,Rf 分别为:1.65、1.40、1.70倍,表明GA5一定的逆转VP-16耐药的活性。3、RNA-Seq结果显示,(1)MCF-7/Adr与MCF-7细胞株相比,多药耐药基因ABCB1、BCL2A1、ERCC1、GSTP1显著上调,还有相关显著上调基因TENM4、PCDHA12、PLPPR4、GPR78、H1ST1H1B、HFM1、CAVIN-2;显著下调转录基因 BMP6、ANGPTL4、TLE3、NDRG1;(2)GA5 作用后的 MCF-7/Adr 与 MCF-7细胞相比,TENM4、PCDHA12、PLPPR4、GPR78、HIST1H1B、HFM1、CAVIN-2基因显著下调;BMP6、ANGPTL4、TLE3、NDRG1基因显著上调。4、qRT-PCR结果显示,(1)以MCF-7为对照组,MCF-7/Adr细胞中ABCB1、BCL2A1、ERCC1、GSTP1基因转录水平上调,表明MCF-7/Adr细胞为多药耐药细胞模型;(2)以MCF-7为对照组,MCF-7/Adr细胞中TENM4、PCDHA12、PLPPR4、HFM1、GPR78、CAVIN-2、ANGPTL4、HIST1H1B 基因转录水平上调,TLE3、BMP6、NDRG1基因转录水平下调;(3)以MCF-7/Adr为对照组,8μM GA5 浓度作用于 MCF-7/Adr 12h、24h、48h 后,TENM4、PCDHA12、PLPPR4、GPR78、HIST1H1B 基因转录水平下调;HFM1、CAVIN-2、ANGPTL4、TLE3、BMP6、NDRG1基因转录水平上调;根据以上RNA-seq结果和PCR结果的一致性,选取NDRG1、BMP6、TLE3基因作为后期验证。5、Western Blot结果显示,以MCF-7为对照组,MCF-7/Adr细胞中TLE3蛋白水平上调与qRT-PCR结果不一致,NDRG1蛋白水平上调差异没有统计学意义,BMP6蛋白水平下调;以MCF-7/Adr为对照组,8μM的GA5作用于MCF-7/Adr 12h、24h、48h后,TLE3蛋白水平下调,BMP6蛋白水平上调,NDRG1蛋白水平未出现明显变化。[结论]1.化合物GA5具有克服乳腺癌耐药细胞MCF-7/Adr耐药性的作用,对耐药细胞的活性明显高于敏感细胞MCF-7;2.在本实验条件下,化合物GA5在耐药细胞MCF-7/Adr未显示出明显的逆转其它化疗药物耐药性的作用;3.化合物GA5克服MCF-7/Adr耐药性可能与其对骨形态发生蛋白6(BMP6)的作用有关,但具体的作用机制尚不清楚。