桦褐孔菌多糖提取与体外抗肿瘤作用研究

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1、通过液体培养分别筛选了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、地瓜淀粉、玉米淀粉、玉米面、乳糖、甘露醇8种碳源和豆粉、麸皮、玉米面、蛋白胨、酵母膏、NH4HCO3、NaNO3、NH4NO38种氮源,并最终通过正交试验确定培养基。结果表明:以葡萄糖作碳源时,菌球干重最大,为2.92g/L;葡萄糖组和地瓜淀粉组的多糖含量显著高于其他碳源组;对pH的记录说明发酵液pH自4-6呈上升趋势,桦褐孔菌F1菌株在培养过程中不断的分泌碱性物质。以酵母膏为氮源的条件下测得的菌球干重最大为9.18g/L,其次是碳酸氢铵和蛋白胨,分别为8.12mg/L和7.56mg/L;蛋白胨组的蛋白含量变化幅度较大,开始上升缓慢,第10天起上升较快,达到2.54mg/ml最大值。正交试验结果分析显示最佳培养基配方应为:蔗糖4%,蛋白胨0.25%,KH2PO40.3%,MgSO40.05%,接种量为10%。供试的5个因素中,对试验结果的影响程度大小依次为:碳源>MgSO4>KH2PO4>氮源>接种量。   2、本文对几种多糖提取方法进行了筛选,采用热水提取法。通过对料液比、提取时间、提取次数、提取温度和初始提取pH的初步试验,确定的条件为料液比1∶40,提取时间为2h,提取温度100℃,初始提取pH=8,提取2次,此法最终多糖提取率为14.98%。通过正交试验确定的优化条件为提取温度100℃,料液比1∶40,提取时间2.5h,最佳pH为8,提取次数为3次。   3、本章采用前面的蔗糖4%,蛋白胨0.25%,KH2PO40.3%,MgSO40.05%作为中试发酵培养基,接种量4%,转速180r/min,通气量0.5-2vvm,罐压0.01-0.02kg/cm2,温度28℃,培养时间7d。适时终止发酵,sevage法脱除粗提物中的蛋白成分,用H2O2脱色,水溶液装入透析袋透析除去小分子盐杂质。通过葡聚糖凝胶柱层析进一步纯化。   4、分别用所得的桦褐孔菌几个样品对食管癌EC109细胞株、乳腺癌MDA细胞株、宫颈癌Siha细胞株进行体外抗肿瘤效果测试。结果表明:桦褐孔菌多糖几个样品对EC-109细胞的抑制率均在20%以上,而醇溶组分在联合化疗药物5-氟尿嘧啶后抗瘤作用大增,子实体醇溶联合组达到了所有药物组中最高的50.68%,大大超过了阳性对照的24.20%;对MDA乳腺癌细胞试验中,仅有胞外多糖粗提物和子实体多糖粗提物有较强的抑制作用,最好抑制率分别为78.14%和85.85%,与阳性对照的82.70%相差无几,而联合用药组抑制率均在80.10%-83.33%的范围内,几乎与阳性对照平齐,联合用药意义不大;纯化后子实体多糖和子实体多糖粗提物对Siha宫颈癌细胞有较高的抑制作用,最好抑制率分别为47.77%和47.87%,阳性对照的抑制率为59.57%,联合药物各组效果较好,其中发酵全液醇溶联合组和子实体醇溶联合组抑制率最高,达67.48%和67.95%,效果较令人满意。
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