肾移植是目前终末期肾病患者最理想、最经济的一种治疗方法,以同种异体尸体肾移植为主,移植后易发生排斥反应。尽管随着现代强效非特异性免疫抑制剂的发展和临床应用,同种异体器官移植取得了长足的进步,急性排斥反应发生率明显减少,但急性排斥反应临床表现也越来越不典型,往往需要移植肾病理学检查。虽然病理学检查是临床诊断的金标准,但此法即昂贵又不方便还易引起肾损伤导致各种并发症。因此,寻找经济方便、无创伤、具有高度敏感性和特异性的检测指标对预测急性排斥反应的发生和提高移植肾的存活率十分重要。器官移植排斥反应主要是激活了受体体内的细胞免疫机制,即受体免疫系统识别异体抗原引起效应T细胞激活和释放一系列效应分子攻击和排斥异体移植器官。T细胞在移植排斥反应中起核心作用。T细胞活化、克隆增殖和产生细胞因子需要两种信号参与：第一信号是由T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)表面的MHC抗原复合物相互作用产生；第二信号为共刺激信号,由可溶性共刺激分子或APC表面的分子配体提供。B、T淋巴细胞衰减因子(B and T 1ymphocyte attenuator, BTLA)是近年发现的免疫球蛋白表面分子家族成员,其与细胞毒T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序坏死因子-1(PD-1)构成了一组抑制性受体,主要在T、B淋巴细胞上表达。BTLA与其配体结合后,对活化的T细胞可产生抑制效应,从而防止过强的细胞免疫应答,维持免疫耐受,保护机体免受自身免疫反应的损伤。疱疹病毒进入介质(Herpes Virus Entry Mediator, HVEM)是BTLA的特异性配体,二者结合产生协同抑制信号；而HVEM与肿瘤坏死因子超家族成员LIGHT结合则产生协同刺激信号。可诱导共刺激分子(inducible costimulator, ICOS)是T细胞膜表面的共刺激因子,其配体ICOSL,亦称为GL-50、B7相关蛋白-1(B7RP-1)或B7同源蛋白(B7h),参与T细胞效应阶段的调节,对T、B淋巴细胞的增殖与活化、各种细胞因子的产生与分泌起重要作用。ICOS/ICOSL共刺激通路阻断后伴有多种细胞因子和趋化因子的下调。研究目的本研究旨在明确肾移植患者以临床常规使用的免疫抑制剂三联治疗措施预防急性排斥反应过程中,BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL在外周血淋巴细胞表达及血清相关细胞因子的变化。评价BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL对肾移植急性排斥反应发生的早期预测作用,为临床早期诊断提供新的无创伤、具有高度敏感性和特异性的急性排斥反应预测指标,以便预防和及时治疗肾移植急性排斥反应,提高患者移植肾的存活率,改善肾移植患者的生存率和生活质量。研究方法1.标本采集：选取自我院2008年2月至2011年2月终末期肾病患者行肾移植手术281例,尸体供肾,热缺血时间<8min、冷缺血时间<10小时,肾移植术后应用MMF+CSA+Pred或MMF+FK506+Pred三联药物治疗,排除应用赛尼哌、OKT3、ALG等单克隆抗体、多克隆抗体的患者,以排除对监测指标的影响；排除发生术后感染、手术等并发症；排除发生移植肾功能延期恢复者。根据Banff2005标准诊断急性排斥反应并进行分组,分为移植肾功能稳定组和肾移植急性排斥组。入组的急性排斥患者必须满足发生AR时间为10±2天,并且应用MP冲击治疗3天(MP500mg/d)效果显著,排斥得到逆转这一条件,不符合者剔除。随机选取20例移植肾功能稳定患者、20例发生急性排斥反应患者。观察40例病人一般情况,尿量、肾功能、血药浓度、T细胞亚群等,于手术当日(术前)及术后第3、7、14、28天采集外周血分离淋巴细胞和血清进行实验。本研究获得医院伦理委员会审核同意。2. RT-PCR、实时荧光定量PCR检测外周血淋巴细胞中BTLA/HVEM、ICOS/ICOSL mRNA表达水平。采用TRIZOL法提取RNA,由公司合成Primer Primier 5设计的引物序列,进行常规PCR反应。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,利用凝胶成像系统拍照,并读取、分析像素值。3.流式细胞术检测外周血淋巴细胞BTLA/HVEM、ICOS/ICOSL的表达水平。4.酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的浓度。取肾移植术前及术后3、7、14、28天的外周血,分离血清-80℃保存。血清中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的含量的检测严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作,并用酶标仪在450nm波长测量O.D.值。5. SPSS 12统计软件、Graphpad Prism5.0统计学软件分析数据,比较术后不同时间、不同组别之间共刺激分子或共抑制分子及细胞因子表达水平差异,并分析与肾移植急性排斥反应发生的相关性。计量资料采用均数±标准差(χ±S)表示,采用两个独立样本t检验比较CR组和正常组的均数,数据间比较应用方差分析,技术资料采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.两组病人一般临床特征,包括性别、年龄、热缺血时间、冷缺血时间及术后免疫抑制剂方案等方面,两组间比较均无统计学差异(P>0.05)。2.外周血淋巴细胞BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL表达水平：RT-PCR、q-PCR和流式细胞术结果一致显示,移植后第3天各分子相对表达量较移植前明显升高,第7、14、28天各分子相对表达量逐渐下降。而肾移植术后发生急性排斥反应的患者BTLA、HVEM、ICOS、ICOSL表达水平与肾功能稳定组相比都有显著升高,以术后第7-14天BTLA、ICOS升高最为显著(P<0.01)。3.外周血淋巴细胞IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4mRNA表达水平：移植后第3天各分子相对表达量较移植前明显升高,肾功能稳定组用药后第7、14、28天各分子相对表达量逐渐下降,肾移植术后急性排斥组IL-2、IFN-γ表达水平在第14天出现显著升高(P<0.01),与移植排斥反应出现的时间密切相关。4.血清IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4浓度：移植后第3天各分子血清浓度较移植前明显升高,肾功能稳定组用药后第7、14、28天各分子血清浓度逐渐下降,肾移植术后急性排斥组IL-2、IFN-γ表达水平在第14天出现显著升高(P<0.01),与移植排斥反应出现的时间密切相关。5.分析BTLA、ICOS表达与急性排斥反应发生的相关性：BTLA、ICOS及细胞因子IL-2和IFN-γ均较临床指标(BUN、Cr)能够提前判断是否发生急性排斥反应。外周血淋巴细胞上的BTLA、ICOS与临床指标比较P<0.01,细胞因子IL-2和IFN-γ与临床指标比较P<0.05,说明这几项指标与临床诊断指标相比具有显著的统计学差异,可以比临床现有诊断指标提前预知肾移植患者移植后是否发生急性排斥反应。6.将各指标联合,观察联合指标与临床确诊的符合情况：判断各组合指标的灵敏度都比较好,从单个指标来看,IL-2的效果最好,其灵敏度和特异度都比较高,其Youden指数达到0.8500,尤其是在检测了IL-2这个指标之后,在任意添加其他一个指标或多个指标,其灵敏度都达到100%。在BTLA、IFN-γ及组合BTLA+IFN-γ、ICOS+IFN-γ这几个指标的灵敏度都比较高,但是特异度较低,容易造成假阳性结果。BTLA和ICOS作为单个指标,其灵敏度和特异度都比较高,二者联合之后的灵敏度和特异度也比较高。结论本研究通过RT-PCR、q-PCR及流式细胞术等方法检测了肾移植患者术前与术后不同时间段外周血淋巴细胞中BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL的表达水平,以及相关细胞因子在外周血淋巴细胞的基因表达和血清浓度变化。结果显示,术前BTLA/HVEM和ICOS/ICOSL均表达不明显,术后第3天均表达明显增加,用药后第7、14、28天表达水平逐渐下降；器官移植急性排斥反应常发生于术后5天-3月,细胞因子的变化可以作为排斥反应发生的指标之一。本研究证明BTLA、ICOS的表达增加出现在排斥反应发生之前,说明可以利用BTLA、ICOS早期预测移植肾排斥反应的发生。