皮肤创伤的发病率高,修复过程复杂,易造成愈合不良等问题,产生巨大的经济、社会负担,严重影响患者的生活质量。临床上对皮肤外伤常规采用清创、抗炎等治疗手段以抗感染促进创面愈合,而且常使用抗生素辅助抗炎来自然愈合,容易带来抗生素滥用造成的各种严重不良后果,最终延缓愈合或始终难以愈合。目前临床促进皮肤创伤愈合尚无特效治疗方案,针对上述问题,基础研究者和临床工作者从动物实验到临床RCT等进行了大量的研究探索,试图找到更经济、实用、易于操作的促进创伤愈合的治疗方案。艾灸可以促进改善创伤局部微循环状态,临床上常用于褥疮等难愈性创伤的治疗。因此,本研究将从形态学和分子生物学角度探索艾灸对全层皮肤切除创伤模型愈合的效应及其机制。艾灸干预的起效与神经系统和免疫系统的交互作用关系密切。在神经源性炎症中,降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质(SP)是皮肤感觉C纤维末梢最初释放的神经肽类物质,也是最重要的肽类物质,均可以诱导神经源性炎症反应,继而通过轴突反射启动抗炎免疫反应,加速愈合的过程。并且,SP和CGRP表现出一定的协同作用。创伤愈合可以分为止血、炎症反应、细胞增殖和组织重构儿个基本阶段,其中炎症期最为关键,包括炎性细胞的募集和凋亡、细胞因子的合成和释放等,如果在炎症期受到抑制不能进入修复期,将导致外伤的迁延不愈或者愈合不良。中断或延长(超过3周)炎症期会导致伤口愈合转向慢性、愈合受损,或者最终形成更多疤痕。炎症期结束,细胞增殖和迁移活动才能开始从而进入创伤修复的下一个阶段。神经-免疫调节能迅速活化大量参与免疫反应的白细胞。基于神经水平的免疫调节是间接作用于免疫器官和免疫细胞,与传统的免疫调节相比有所不同,是近年来关注的热点。针灸是一种小微创的治疗,可以引起局部SP/CGRP的释放,基于艾灸促进SP/CGRP快速释放加速局部的神经源性炎症的发生,调节炎症细胞和相关细胞因子的反应,促进机体炎症反应活动,以加速炎症反应进程,使创伤修复提前进入增生修复阶段,实现促进和加快创伤愈合。本研究聚焦于艾灸促进外伤局部的神经源性炎症反应,加速外伤的修复进程。1实验目的选用健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠为研究对象,观察艾灸对创伤模型大鼠创口愈合的效应。在确定艾灸可明显促进皮肤创伤愈合的基础上,通过荧光免疫组织化学、HE和Masson染色的形态学手段,以及Elisa和液态芯片法检测蛋白含量的分子生物方法,探讨艾灸干预对创伤愈合炎症期表达曲线的影响,以及对不同阶段创伤局部组织形态的修复作用,为相关基础和临床研究提供借鉴。揭示艾灸促进伤口愈合效应的神经生物学机制。2实验方法本实验研究分为两个阶段第一阶段主要观察艾灸对创伤模型大鼠创口的促愈效应:实验选用SPF级健康雄性12周龄SD大鼠38只,随机分成模型组和艾灸干预组,用直径8 mm的皮肤钻孔从大鼠背部正中线肩胛下角2 cm处钻取全层皮肤来制备大鼠创伤模型。造模后即刻(DO)至造模后第5天(D5),在异氟烷气体浅麻醉状态下给予持续25分钟的艾条回旋灸干预,每日1次,共6次,模型组只给予相同条件的浅麻醉而不施灸。每次干预后观察并拍照记录创面的愈合情况,用软件对创面愈合面积进行计算和统计(用软件测出的是创口的像素面积,根据图片所附实际标尺1cm长度对应的像素长度,换算出实际面积,愈合面积=初始面积-当前的面积)。造模后第2天和第7天,每组取6只鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定后取伤口及其周围组织进行组织学石蜡切片,采用HE和Masson染色分析各组大鼠创伤局部组织细胞浸润和胶原纤维生长的形态学变化。第二阶段主要探讨艾灸促进创伤模型大鼠伤口愈合的神经生物学机制:选用相同条件的SD大鼠102只,随机分成正常组,模型组和艾灸组,造模和干预方法同第一部分。形态学检测:在创伤后第1、2、3、5天,取模型组和艾灸组大鼠每组各3只,用4%多聚甲醛经心脏灌注固定后取创面及其周围皮肤组织进行冰冻切片,采用荧光免疫组织化学染色技术标记SP、CGRP、CD31和巨噬细胞M1、M2型的阳性表达,并镜下观察其表达变化情况。分子生物学检测:在造模后第1、2、3、5天分别取艾灸组与模型组各9只鼠,断头采集大鼠血样和创伤局部及周围皮肤组织,同时采集正常组大鼠血样与皮肤组织,采用液态芯片法检测各组大鼠血清中细胞因子 IL-1α IL-1β、IL-2、IL-6、IL-4、IL-10、IL-7、IL-12、IL-13、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、MIP-1α VEGF 的蛋白含量,用 Elisa 检测创伤局部皮肤组织的CGRP蛋白含量。通过分析艾灸对创伤愈合过程中炎症期炎性细胞(主要为巨噬细胞的M1、M2表型分化),促炎和抗炎细胞因子及神经肽表达的影响,探讨艾灸调节炎症反应促进伤口愈合的机制。3实验结果3.1艾灸对创伤模型大鼠伤口愈合的效应3.1.1艾灸促进创伤模型大鼠伤口创面愈合艾灸2次后,大鼠伤口面积较模型组显著减小(P<0.01,P<0.05),愈合面积显著增加(P<0.01),且随着艾灸干预增加从0到5天愈合面积显著增加。3.1.2艾灸促进创伤模型大鼠局部组织的炎性细胞聚集,加速炎症过程,降低炎症渗出采用HE染色观察到:造模后第2天,艾灸组的创伤局部组织中炎性细胞募集、浸润显著增多(P<0.01),根据细胞形态判断募集到该处的炎性细胞多数为中性粒、单核/巨噬细胞和肥大细胞。造模后第7天,艾灸组创伤局部组织结构更加致密,细胞形态多样,排列紧密,且相对有序,主要由成纤维细胞和胶原纤维构成,受损部位的皮肤结痂增厚。3.1.3艾灸促进创伤模型大鼠的胶原重建Masson染色观察到:造模后第2天,艾灸组的创伤局部组织中胶原纤维增生数量明显增多(P<0.05),且呈现出从创口表面向下均匀分布的态势,而模型组则出现在皮肤真皮较深的部位。胶原纤维由成纤维细胞生成,提示成纤维细胞在此阶段开始向创伤局部迁移、增殖:造模后第7天,艾灸组的创伤局部组织中胶原纤维较粗大且排列更加紧密,新生血管数量增加。3.2艾灸促进创伤模型大鼠伤口愈合的机制探讨3.2.1艾灸促进创伤模型大鼠血清促炎和抗炎细胞因子的释放模型组大鼠血清中促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6的蛋白含量在创伤前5天呈现先升高后降低的趋势,峰值均出现在第3天。艾灸组IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6在造模后1-5天的表达曲线较模型组左移,峰值出现在第2天。艾灸组大鼠血清中IL-1α和IL-6的含量在造模后第1天明显高于模型组(P<0.05),IL-2在造模后第2天显著升高(P<0.05),IL-1β则在造模后第1、2天均明显升高(P<0.05,P<0.01)。造模后第3天,艾灸组血清IL-1α、IL-1β、IL-2和IL-6的蛋白含量均显著低于模型组(P<0.05)。艾灸组在造模后第3大大鼠血清中IL-1α IL-1β、IL-2及IL-6的含量降至造模后第1天水平,模型组则在造模后第5天回到第1天的水平。两组大鼠血清中11-7和IL-12的表达,无统计学差异,但趋势与IL-1α IL-1β、IL-2及IL-6的表达一致。说明艾灸促进了致炎因子的表达,加速了炎症期的反应。模型组大鼠血清抗炎细胞因子IL-4,IL-10,IL-13的蛋白含量在创伤前5天同样呈现先升高后降低的趋势,IL-4的表达峰值出现在第2天,IL-10,IL-13的峰值出现在第3天。艾灸组IL-4,IL-10,IL-13在造模后1-5天表达曲线与模型组相比同样出现明显左移。造模后第1天,艾灸组大鼠血清中IL-4的蛋白含量显著升高(P<0.05),第1、2天IL-10的蛋白含量显著升高(P<0.05,P<0.01),在造模后第3天,血清中IL-4,IL-10的蛋白含量均显著降低(P<0.05)。艾灸后创伤模型大鼠血清中IL-13的表达虽无统计学差异,但与IL-10呈现出相同的趋势。说明艾灸加速了抗炎因子的表达,加速了炎症的进程。3.2.2艾灸促进创伤模型大鼠血清趋化因子的募集造模后第1～5天,模型组大鼠血清中G-CSF和GM-CSF的含量表现出先升高后降低的趋势,表达高峰出现在第2天,M-CSF的表达高峰出现在第5天。艾灸组血清中的G-CSF、M-CSF和GM-CSF的蛋白含量也呈现出先升高后降低的趋势,G-CSF和GM-CSF在造模后第1、2天升高,第3、5天降低;M-CSF的表达峰值出现在第3天。提示艾灸加速了炎性细胞募集。模型组的炎性细胞募集持续时间可能更长,炎症反应结束的可能更晚。造模后第1～3天,艾灸组大鼠血清中MIP-1α的蛋白含量均升高,且在造模后第2天显著升高(P<0.05),到第5天时表达下降。在创伤局部及周围组织中,两组大鼠MIP-1α的含量均呈现出逐渐升高的态势。艾灸组的MIP-1α的含量在第2和第5天时显著高于模型组(P<0.05,P<0.01)。总体而言,模型组升高趋势平缓,艾灸组第5天时明显升高,提示艾灸干预可能促进了 MIP-1α从循环系统向创伤局部组织的渗出,从而加快炎症反应进程。3.2.3艾灸促进创伤模型大鼠局部组织巨噬细胞由M1型向M2型分化造模后第3天,艾灸组的CD68和TNF-α共标的M1型巨噬细胞表达减少,CD68和CD206共标的M2型巨噬细胞表达增多,提示艾灸干预可能促进了巨噬细胞由M1向M2型的分化,提前启动了巨噬细胞的抗炎免疫反应。3.2.4艾灸促进创伤模型大鼠局部组织的血管新生和重建造模后第1～5天,艾灸组大鼠血清中VEGF的蛋白含量较模型组升高,且在第1～2天时显著升高(P<0.05,P<0.01),第3和第5天仍维持在较高水平。在创伤局部周围皮肤组织中,艾灸组大鼠造模后第1～3天VEGF的蛋白含量无明显变化,第5天时则较模型组显著升高(P<0.01)CD31标记血管内皮细胞的荧光免疫组织化学结果显示,造模后前3天,两组均未见明显CD31的阳性表达,而艾灸组大鼠在造模后第5天CD31的阳性表达明显增加,提示创伤组织中新生血管数量明显增加,结果与VEGF定量结果一致。3.2.5艾灸促进创伤周围局部组织CGRP和SP释放加速炎症反应造模后第1天,艾灸组CGRP的表达较模型组增加,其表达特点为:在表皮、表皮-真皮交界、真皮浅层均有表达,而模型组只在真皮层有少量表达。第3天时,呈现出相同的趋势,但表达增加更明显,在第1天的基础上,出现了毛囊周围、血管伴行的高表达。Elisa蛋白定量结果显示,造模后第1、3天,艾灸组的局部组织中CGRP的蛋白含量增加,且第3天时显著增加(P<0.01),与形态学结果一致。造模后第1、3天,艾灸组SP的表达较模型组增加,其特点与CGRP的表达类似:在表皮、表皮-真皮交界、真皮浅层均有表达,而模型组只在真皮层有少量表达;造模后第3天时,保持与第1天相同趋势的同时新出现血管伴行表达。提示艾灸干预通过促进CGRP和SP释放加速炎症反应的同时,也促进了创伤局部组织的去神经支配和损伤血管的恢复。4结论1艾灸干预明显促进皮肤创伤模型大鼠的创伤修复,缩短创伤愈合的进程。2艾灸可显著促进创伤模型大鼠血清中炎症期促炎性细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2和IL-6以及抗炎性细胞因子IL-4和IL-10的动态表达曲线左移,促进创伤炎症期炎症反应,并缩短炎症期促使创伤修复提前进入细胞增殖期。3艾灸可增加创伤模型大鼠血清中与巨噬细胞关系密切的趋化因子G-CSF、GM-CSF、M-CSF的含量,并且调控创伤局部巨噬细胞从M1向M2型转化,提示艾灸干预通过影响巨噬细胞分型促进了炎症期反应,缩短炎症期提前进入修复期,加速创伤的愈合。4艾灸可增加炎症期血清及创伤周围局部皮肤组织中VEGF的含量,促进血管内皮细胞CD31阳性细胞的表达,促进了创伤修复期创伤局部血管的新生和重建。5艾灸可以增加创伤周围组织中神经肽SP/CGRP的表达,主要表达在表皮下和血管周围,诱导神经源性炎症反应的发生,提示艾灸促进神经肽的释放,诱导下游的神经免疫反应使其快速进入修复期来促进外伤的愈合。