近年来,多种超分辨荧光显微技术提高光学衍射极限分辨率10~20倍,达到几十纳米量级,科学家们可以对细胞内特定细胞器、病毒以及蛋白质等在三维空间的精确定位和分布进行研究,对于理解生命过程和疾病发生机理具有重要意义。然而,在活细胞成像过程中,由于时空分辨率之间相互制约的关系,现有的超分辨显微技术,大多存在时间分辨率较差、激发光强度大、系统结构复杂等问题,不利于对活细胞进行动态检测,而比较适合于固定细胞成像。其中,超分辨定位显微(super resolution localization microscopy,SLM)和超分辨光学涨落成像(super-resolution optical fluctuation imaging,SOFI)技术,就是利用荧光分子的闪烁特性,通过分时成像,重构一组图像序列的定位(SLM)或相关信息(SOFI)得到一幅超分辨图像,导致时间分辨率较差,难以对某些活细胞内纳米尺度动态过程进行成像。本论文针对SLM和SOFI两种成像方法,重点研究如何提高超分辨成像速度,为研究活细胞内动态过程提供新的技术方法。本论文的主要工作如下:1.提出一种结合受激辐射与单分子定位技术的快速超分辨显微方法在SLM中,为了不降低单分子定位精度,同时缩短每帧图像的曝光时间,需提高荧光分子的发光速率(单位时间内单分子辐射的光子数)。提出在荧光分子电子能级结构中引入受激辐射过程,使之产生受激辐射信号;并将受激辐射与单分子定位技术结合,提出一种超分辨定位受激辐射显微方法。理论计算结果表明受激辐射可提高荧光分子的发光速率几十倍,在模拟结果基础上,利用超分辨定位受激辐射显微获得了横向30 nm和0.05 s的超高时空分辨率。2.利用统计理论分析,研究了SOFI图像的信噪比与荧光闪烁参数之间的量化关系SOFI通过统计一组随机闪烁图像序列的累积量来突破光学衍射极限,其图像值不是荧光分子所发射光子的强度,而是一个随时间振动信号的统计量。传统的图像信噪比分析理论并不适用于SOFI技术,对某些实验现象无法给出物理解释。利用统计理论分析SOFI图像的信噪比;计算累积量信噪比与荧光闪烁的参数:包括亮态几率、相机帧频与平均闪烁速率之比、光振幅和序列长度之间的量化关系,为SOFI实验提供物理解释和理论指导;通过模拟SOFI图像,验证累积量统计噪声是引起SOFI图像非均匀现象的原因。3.提出基于标准差的解卷积优化SOFI算法,提高超分辨成像速度2-10倍根据统计噪声理论,有限长序列下累积量估计的误差,致使重构SOFI图像出现严重的非均匀和非连续现象。利用统计方差公式,求得SOFI图像每个像素的标准差,并将结果引入后续的Lucy-Richardson解卷积算法中作为迭代优化的偏差阈值,达到抑制噪声,提高图像质量的目的。模拟和实验结果表明,在相同序列下,基于标准差的解卷积优化SOFI方法,显著提高了重构图像的均匀性和连续性;在同等图像质量下,该优化算法可缩短图像序列至原来的一半至十分之一,提高超分辨成像速度2-10倍。4.开展基于聚合物量子点的SOFI实验小尺寸光闪烁聚合物量子点(semiconductor polymer dots,Pdots)具有高亮度、超强光稳定性及优异生物相容性等特点,适用于高时空分辨SOFI技术。开展基于Pdots的SOFI实验,利用提出的优化SOFI算法,处理Pdots标记的子宫颈癌细胞(Hela细胞)内微丝结构图像,利用50张原图重构,提高宽场显微图像的空间分辨率约2.2倍。本论文工作的创新点是,提出一种结合受激辐射与单分子定位技术的快速超分辨显微方法;利用统计理论分析,获得了SOFI图像的信噪比与荧光闪烁参数之间的量化关系;提出基于标准差的解卷积优化SOFI算法,提高超分辨成像速度2-10倍。