论文部分内容阅读
2,5-二羟甲基-3,6-二甲基毗嗪(Liguzinediol),是一种毒性较小,具有心脏安全性,可用于治疗急性心衰的化合物。它通过影响肌浆网钙释放,增加大鼠在体和离体的心脏收缩力,对正常大鼠及其离体心脏起到较好的正性肌力作用。课题组前期对Liguzinediol在大鼠体内的药代动力学、雌雄差异及药物代谢产物进行了研究报道。根据一类新药研制的要求,本文首次建立了检测比格犬血浆中Liguzinediol浓度的LC-MS/MS方法,并研究了比格犬静脉注射Liguzinediol后的血浆药代动力学,同时系统地研究了 Liguzinediol在雌、雄大鼠体内的吸收、分布、排泄及代谢的药代动力学过程,为Liguzinediol的进一步开发和临床研究提供必要的实验依据。本文研究内容主要包括以下方面。一、Liguzinediol在比格犬体内血药浓度的测定及药代动力学研究建立了测定比格犬血浆中Liguzinediol浓度的灵敏、快速的LC-MS/MS测定方法,探讨其在比格犬体内的药代动力学。血浆样品加入内标(咖啡因)经甲醇提取后,高速离心,取上清液进行LC-MS/MS分析。采用色谱柱为XR-ODS column(2.0mm×50mm,2.2μm),流动相为甲醇-0.1%甲酸梯度洗脱,流速为0.4 mL·min-1,柱温40℃。质谱采用ESI离子源,多反应监测模式(MRM)进行正离子检测,Liguzinediol和内标咖啡因的选择性检测离子分别为m/z 169.2→122.2和m/z 195.2→110.2。比格犬,每组为6只,雌雄各半,分别静脉给药1.6,3.2,6.4mg·kg-1,口服给药3.2mg·kg-1后,测定给药后不同时间的血药浓度,利用DAS软件计算药代动力学参数。结果表明Liguzinediol的血药浓度在5～10 000ng·ml-1范围内线性范围良好(r=0.999 6)。方法学考察均符合要求,日内、日间精密度(RSD)均小于15%,符合生物样品分析要求。结论:该方法操作简便、灵敏、快速、专属性强,可用于Liguzinediol在比格犬体内的药代动力学及成药性研究。选用每组6只比格犬前肢静脉给予Liguzinediol,三个给药剂量1.6,3.2,6.4 mg·kg-1的血药浓度-时间曲线经非房室模型拟合后,其三个剂量的消除半衰期T1/2分别为0.369±0.021 h、0.584±0.246h、0.567±0.087h,曲线下面积 AUC 分别为 1195.4±172.46、2598.2±1147.1、5448.7±943.7ng·h·mL-1。选用6只比格犬口服给予中剂量3.2mg kg-1 Liguzinediol,血药浓度-时间曲线经非房室模型拟合后,半衰期T1/2为0.431±0.106 h,达峰时间Tmax为0.333±0.129 h,药峰浓度Cmax为 2703.2±719.3 μg·L-1,曲线下面积 AUC 为 2066.1 ±358.0 ng·h·mL-1。二、Liguzinediol的蛋白结合率测定本文采用了平衡透析法测定Liguzinediol在大鼠血浆中的蛋白结合率。透析浓度在5～25μg·ml-1内,平均蛋白结合率为3.88%。蛋白结合率较低表明只有少量的Liguzinediol与血浆蛋白结合,大量的Liguzinediol以游离形式存在于血液中。三、Liguzinediol在大鼠体内的组织分布研究建立了 LC-MS/MS的方法测定Liguzinediol在大鼠体内的分布,并测定了雌雄大鼠体内十三个脏器(心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、小肠、脑、胰脏、脂肪、卵巢、睾丸)4个时间点(1Omin、1、2、8h)的Liguzinediol含量,进行了组织器官的分布研究。在静脉注射Liguzinediol10mg·kg-1后,发现药物能分布到大部分组织中,雌雄差异明显。与同一时间点的血药浓度相比,药物在组织中含量相对较少。Liguzinediol在雄性大鼠心脏、肌肉、肾脏及胰脏中分布较多,胃、小肠及肝脏中分布较少,其它脏器分布较为均匀。脑组织中也能测得药物浓度,说明Liguzinediol可以通过血脑屏障。10min时Liguzinediol在各组织中的浓度最高,但是在给药1h后,各组织中的药物浓度明显降低,在8h后大部分组织中已经检测不到Liguzinediol,说明其在体内的分布较为迅速,且无蓄积。与雄性大鼠相比,雌性大鼠在静脉注射Liguzinediol 10 mg·kg-1后,发现药物也能在短时间内就能分布到大部分组织中,但同一时间点组织中含量明显高于雄性大鼠,与药代动力学研究中雌性大鼠代谢慢于雄性大鼠相符。其中肌肉、心脏、肾脏及卵巢中分布较多,胃、脂肪中分布较少,其它脏器分布较为均匀。10min时Liguzinediol在各组织中的浓度最高,给药2h后Liguzinediol在各组织中的浓度随时间延长而逐渐降低,给药8 h后,各组织中的药物浓度明显降低。四、Liguzinediol在大鼠体内的排泄研究及代谢产物初步研究建立了大鼠胆汁、尿液及粪便中Liguzinediol浓度的LC-MS/MS测定方法,并进行了方法学考察。大鼠静脉注射给予Liguzinediol 10 mg·kg-1后,不同的时间收集的胆汁、尿液、粪便中均能检测出Liguzinediol。胆汁24h内雄性大鼠的累计排出量为0.49%,雌性为0.99%,尿液中48h雄性大鼠原形药累计排出量为1.22%,雌性为5.31%,粪便中48h内雄性大鼠原形药累计排出量为3.71%,雌性为7.42%。约有80%以上的药物有待探明去向。本文对Liguzinediol在大鼠体内(尿液、粪便、胆汁中)的代谢产物进行了研究,建立了大鼠胆汁、尿液及粪便中代谢产物检测的LC-MS/MS方法,采用TOF MS模式对胆汁、尿液、粪便样品的进行预扫描,检测到了多个代谢产物,针对其中质谱响应较高的5种代谢产物用MDF-IDA实时采集的方法进行再次扫描,在胆汁和尿液中找到一种Ⅰ相代谢产物和四个Ⅱ相代谢产物,并且研究了代谢产物含量的变化趋势。