[背景]病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）是由病毒感染引起的心肌细胞坏死与局灶性或弥漫性心脏炎症细胞浸润,呈现心功能及血流动力学严重紊乱,约20%病患病情迁延反复发展为慢性心肌炎及扩张性心肌病,迄今机制未完全阐明。B3型柯萨奇病毒（CVB3）感染是VMC的主要病因之一。VMC感染早期病毒对心肌的直接损伤作用和病毒诱导的机体免疫炎症浸润是VMC发病的主要机制。VMC呈现心脏内过度的免疫浸润与炎症提示免疫细胞的调控及其分泌细胞因子出现紊乱。IL-10一直被认为是具有免疫负调控作用的调节性T/B细胞分泌的负性因子,对炎症性疾病具有保护作用。然而,我们的预实验发现IL-10敲除小鼠VMC发病显著减轻,提示有害促炎作用。IL-10根据分泌细胞的不同及作用靶细胞的不同,具有非常大的异质性,不同微环境可发挥促炎、抑炎、激活T细胞/APC和抑制T细胞/APC应答等的截然相反的功能。提示急性VMC发病中IL-10可能起复杂调控作用。[目的]在CVB3诱导的小鼠急性VMC模型中,旨在详尽研究CVB3感染早期IL-10的分泌细胞和分泌特性、及IL-10在急性VMC发病中的作用与机制。[方法]1、C57BL/6小鼠急性CVB3心肌炎模型的建立:1500TCID50剂量CVB3（Nancy毒株）经腹腔注射4-6周龄雄性C57BL/6小鼠。7天小鼠死亡率40%;减重10%;3天心脏病毒滴度4-5LogTCID50/g;心肌组织病理呈现灶性坏死、心肌细胞崩解、炎性细胞浸润,提示急性VMC模型建立。2、H＆E染色:组织4%甲醛固定、脱水、石蜡包块、切5μm切片、苏木精和伊红染色、树脂封片。3、I1-10敲除小鼠感染CVB3:以1500TCID50 CVB3腹腔感染WT/和I1-10 KO C57小鼠,7天内观察小鼠生存率、体重;检测0/3/7天病毒载量;HE染色判断心脏病理;超声心动仪检测心脏功能。4、病毒滴度检测:心脏组织30mg,300μl PBS匀浆取上清,30μl不同稀释度样本加入Hela细胞,37℃ 1小时,PBS洗3次,DMEM-2%FBS维持,连续10天每天观察细胞病变情况,观察按照Reed-Muench方法计算CVB3 TCIDso。5、Western Blot检测病毒蛋白VP-1:30mg组织,加入300μl RIPA裂解液研磨上清,BCA法测定蛋白浓度,-80℃保存,SDS-PAGE电泳,转PVDF膜,经鼠抗anti-VP1一抗-HRP-羊抗鼠抗体作用,显色。6、心超动态成像检测:使用Vevo2100高分辨率微声学系统,对小鼠进行心脏超声检查。在左心室（LV）最大水平上,从短轴和长轴视图获得二维引导的M模回波。从M模图像中测量收缩末期和舒张末期左室壁尺寸。根据测量的心室尺寸计算左室缩短率（FS）和射血分数（EF）。7、免疫组化（IHC）:石蜡切片5μm,脱蜡,去H2O2酶、抗原修复、5%脱脂奶粉封闭、孵一抗,依照 Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB（ABC）Detection IHC kit免疫组化检测试剂盒检测IL-10含量。8、RT-PCR:组织RNA的抽提、逆转录cDNA的、Real-time PCR分析目的基因的表达情况。9、心脏、脾脏、外周血单核淋巴细胞分离:小鼠心脏组织以Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶消化,经40%-80%不连续Percoll密度梯度离心分离淋巴细胞;脾脏研磨、外周血破除红细胞后70μm过滤获得单核淋巴细胞。10、流式细胞术:淋巴细胞经PMA、离子霉素、Golgi阻断剂刺激6小时,收集后先经表面CD45、CD11b、Ly6C、Ly6G、CD68单抗染色;经固定和穿膜后,再以荧光标记anti-IL-10染色,流式测定。11、体外转输巨噬细胞试验:感染CVB3前3天尾静脉注射200μl Clodronate liposome以清除体内巨噬细胞,收集感染3天小鼠（WT和Il-10 KO）腹腔巨噬细胞,以2×106个细胞经尾静脉回输到Il-10 KO小鼠,使用anti-CD68抗体以免疫组化的方式来检验心脏巨噬细胞清除与回输效率。再感染1500TCID50 CVB3,检测生存率、病毒滴度、VMC病理。12、ELISA检测细胞因子:组织20mg,PBS匀浆取上清。依照eBioscience细胞因子检测试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-10、CCL2等蛋白含量。13、统计分析:以Graph Pad Prism5和SPSS 11软件完成,P＜0.05被认为存在显著性差异。实验数据均以Mean+SEM表示;两组间用two-tailed Students’t-test;3 组及以上用 one way-ANOVA 加 Bonferroni post-tests;（病理评分以 Mann-Whitney U test 分析;生存曲线采用 Kaplan Meier survival curves,以log rank（Mantel-Cox）分析组间差异;体重曲线以线性回归分析（linear regression analysis）分析。[结果]1、CVB3感染小鼠可上调IL-10表达。RT-PCR、ELISA、免疫组化和流式细胞术检测IL-10表达,发现:CVB3感染0-3天诱导全身IL-10上调表达;心脏IL-10 day3达峰值,随后有所下降,第7天仍维持一定水平;胰腺和外周血IL-10水平变化与心脏相似。2、IL-10 KO小鼠感染CVB3后疾病易感性和心肌炎发病显著减轻。以1500TCID50 CVB3感染WT和Il-10 KO小鼠,发现:1）与WT小鼠体重显著下降、死亡率10%相比,Il-10 KO小鼠体重未降反轻微上升,7天无死亡;2)较WT小鼠相比Il-10KO小鼠第7天心脏炎症浸润明显减少;胰腺病理差异不显著;3)第7天心肌肥厚标志利钠肽（ANP）和脑利钠肽（BNP）在Il-10 KO小鼠明显减少;4)Il-10 KO小鼠心脏促炎因子MCP-1、IL-6和TNF-α等较WT小鼠显著下降;5)Il-10 KO小鼠心脏左心室射血分数与左心室短轴缩短率均较WT小鼠改善;6)Il-10 KO小鼠3天心脏、胰腺病毒载量显著减少。提示IL-10促进CVB3复制从而促进VMC。3、巨噬细胞是VMC小鼠心脏早期IL-10的重要来源。流式检测外周血与心脏浸润CD45+白细胞,发现:1)心脏和外周血IL-10+CD11b+细胞大于IL-10+CD11b-细胞,提示T细胞不是分泌IL-10主要细胞;2)感染第3天,Ly6G+中性粒细胞（0.089%）较少分泌IL-10,而Ly6Chi单核细胞（0.59%）和CD68+巨噬细胞（0.86%）是分泌IL-10的主要细胞;3)CD11b+LY6G-非中性粒髓系细胞发现CD68+巨噬细胞分泌IL-10的贡献大于CD68-单核细胞。4、过继转输IL-10+巨噬细胞显著促病毒复制加重VMC。感染3天WT和Il-10 KO小鼠来源的2×106个腹腔巨噬细胞,尾静脉回输WT和巨噬细胞清除小鼠,而后感染CVB3。发现:1)巨噬细胞清除小鼠较WT小鼠VMC发病显著减轻;2)I1-10 KO巨噬细胞较WT巨噬细胞输注巨噬细胞清除小鼠的VMC发病显著减轻;3)清除巨噬细胞不影响CVB3复制,巨噬清除小鼠输注Il-10 KO巨噬细胞后,较回输WT巨噬细胞相比病毒滴度显著下降（P＜0.05）,提示巨噬细胞分泌IL-10促进小鼠体内CVB3复制并显著促进VMC发病。5、IL-10不显著影响体内I型干扰素和CRAMP的表达。早期病毒的限速关键因子是Ⅰ型干扰素和抗菌肽,检测第3天Ⅰ型干扰素和抗菌肽表达,发现:WT和Il-10 KO小鼠心脏、胰腺和外周血Ⅰ型干扰素和抗菌肽的mRNA和蛋白质水平无显著差异。提示IL-10不影响体内IFN-Ⅰ应答。6、IL-10通过抑制IFNγ+CD8+T应答促进体内CVB3复制:1)Il-10KO小鼠心脏和外周血IFN-y表达显著增高;2)WT和Il-10 KO小鼠外周血NK数量在感染3天无显著差异,但均较未感染小鼠显著减少（5.7%vs 5.9%vs.14.4%,p＜0.05）,脾脏NK数目无差异;3)Il-10 KO小鼠外周血和脾脏的γδT和Vγ1数目在第3天较未感染增加,但与WT小鼠无差异。4)感染第3天,Il-10 KO小鼠外周血CD8+T和IFN-γ+CD8+T细胞比例和数目较WT小鼠显著增加;5)巨噬细胞清除不影响IFN-γ+CD8+T、granzyme B+CD8+T比例;回输Il-10 KO巨噬细胞的小鼠IFN-γ+CD8、granzyme B+CD8+T细胞应答均较回输WT巨噬细胞的小鼠显著增加。提示巨噬细胞来源IL-10通过抑制IFN-γ+CD8+T和granzyme B+CD8+T细胞的抗病毒应答从而促进CVB3复制。7、早期中和IL-10通过促进IFN-γ+CD8+CTL反应抑制病毒复制:感染小鼠在第0.5天和2.5天腹腔注射IL-10中和抗体,发现:1)早期中和IL-10抑制心肌炎发展和病毒复制;2)早期中和IL-10通过促进IFN-γ+CD8+CTL应答。综上,在CVB3诱导的小鼠急性VCM模型中,我们发现CVB3诱导心脏早期IL-10在第3天显著上调,且主要为心脏巨噬细胞分泌;IL-10敲除小鼠VMC显著减轻而病毒载量减少;I1-10 KO而非WT小鼠来源巨噬细胞回输巨噬细胞清除小鼠可减少病毒复制、减轻VMC发病;巨噬细胞来源IL-10主要通过抑制早期IFN-γ+CD8+T、granzyme B+CD8+T细胞应答促进病毒复制,从而加剧VMC的发生。早期IL-10可作为VMC治疗的潜在靶点。