帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,其发病原因主要为年龄老化、环境影响以及家族性遗传因素,目前缺少有效的治疗手段。位于人类基因组12号染色体上的LRRK2基因的突变将会导致遗传性和散发性PD。很多实验研究表明突变后的LRRK2基因编码的蛋白,激酶活性升高进而导致PD的发生,其中LRRK2 Kinase结构域的G2019S突变体能明显引起神经毒性以及多巴胺能神经元的丢失。因此寻找有效的LRRK2激酶活性抑制剂将是一个重要的治疗PD的途径。本实验从中药单体中筛选出白藜芦醇和大豆异黄酮作为主要的研究对象,首先在鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞上初步验证二者对PD的保护作用和机制,然后在PD转基因果蝇模型以及转基因小鼠模型上进一步验证其对LRRK2激酶活性的抑制作用和机制,通过对不同信号转导通路的研究,初步探讨这两种中药单体作为LRRK2激酶抑制剂对PD的治疗效果和神经保护作用机制。目的:建立毒性PD相关细胞模型,PD果蝇模型,以及不同类型的LRRK2相关转基因PD小鼠模型。分别给药白藜芦醇和大豆异黄酮,观察在细胞模型中细胞凋亡情况和相关信号通路变化,观察在果蝇模型在对PD症状的改善情况,以及LRRK2激酶活性和其下游相关信号通路的变化。方法:1、使用鱼藤酮建立SH-SY5Y细胞毒物PD细胞模型,使用Gal-UAS杂交系统建立的转基因PD果蝇模型,使外源基因LRRK2-G2019S定位表达在多巴胺神经元内。建立LRRK2转基因PD小鼠模型,使已表达外源基因LRRK2-G2019S的杂合小鼠相互杂交,运用PCR技术和测交鉴定获得纯合GS2小鼠模型。另外使GS2杂合小鼠与A53T杂合小鼠杂交,应用PCR鉴定获得GS2-A53T双转基因小鼠。2、挑取雌性果蝇分为五组,给GS2果蝇分别喂食不同浓度的白藜芦醇和大豆异黄酮,观察果蝇的生命周期和行为学变化情况。应用Western Blot检测LRRK2激酶活性以及LRRK2相关信号通路蛋白的表达变化。3、选取不同浓度的白藜芦醇和大豆异黄酮作用于SH-SY5Y细胞,MTT检测细胞存活率,Western Blot检测LRRK2相关信号通路蛋白的表达变化。结果:1、成功获得鱼藤酮PD细胞,GS2转基因PD果蝇,转基因纯合GS2,双转基因GS2-A53T,杂合GS2,杂合A53T以及非转基因小鼠。2、喂药后的果蝇相对于对照组,生命周期明显延长,运动能力也显著提高。不同药物浓度中,100 μM的白藜芦醇作用效果最好,1μM的大豆异黄酮作用效果最好。Western Blot结果显示100 μ的白藜芦醇和1 μM的大豆异黄酮能降低LRRK2激酶的活性,并且对氧化应激相关Nrf2/ARE信号通路,MAPK家族相关ERK,JNK,P38信号通路均有影响。3、药物作用下的SH-SY5Y细胞相对于对照组存活情况明显改善,并且100 nM的白藜芦醇和100 nM的大豆异黄酮作用效果最好,Western Blot结果显示不同浓度下的白藜芦醇和大豆异黄酮对Nrf2/ARE信号通路和ERK,JNK,P38信号通路有不同程度的活化作用。结论:1、成功建立鱼藤酮诱导的PD细胞模型,GS2转基因PD果蝇,GS2纯合转基因小鼠,GS2/A53T双转基因PD小鼠模型。2、白藜芦醇和大豆异黄酮对细胞有明显的保护作用,最佳作用浓度均为100 nM,可能通过活化Nrf2/ARE通路以及JNK、ERK、p38通路发挥神经保护作用。3、白藜芦醇和大豆异黄酮能显著改善果蝇的PD症状,抑制LRRK2激酶活性,并且以100 μ的白藜芦醇作用和1μM的大豆异黄酮作用效果最好。白藜芦醇通过Nrf2/ARE通路以及JNK、ERK通路作用,大豆异黄酮通过JNK、p38和ERK通路作用。