目的：阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是老年人常见的神经系统变性疾病，主要临床表现为进行性记忆障碍和智能减退。本病的主要病理特点为老年斑、神经原纤维缠结和神经元丢失。越来越多的证据表明，β淀粉样蛋白(amyloid-βprotein，Aβ)是AD的共同通路，是AD形成和发展的关键因素，是构成老年斑的主要成分。目前治疗主要是对症为主，尚无有效的治疗手段。在分子生物学迅速发展的基础上开始形成了一种新的疗法-基因免疫法。基因免疫治疗是通过基因编码的蛋白在动物自身的表达诱导免疫反应，产生对抗疾病有关的特异性蛋白的方法，具有高度的特异性和可选择性特点。已通过动物模型和人体实验研究表明，基因疫苗可以减少或清除Aβ。我们实验选用Aβ3-10片段重组构建基因表达质粒pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG，并在真核细胞中转染，探讨其是否可以在真核细胞中表达；随后在AD的3月龄转基因模型鼠APPSWE/PS1进行免疫治疗，观察其行为学改善，可以形成抗Aβ42特异性抗体，减轻Aβ沉积及Aβ斑，说明了该疫苗对3月龄转基因模型鼠APPSWE/PS1有预防保护作用；同时没有脑内炎症反应发生，在重要脏器中无病理改变，说明该疫苗的安全性。本实验证明该疫苗是一种安全有效疫苗，为进一步的临床试验治疗提供了参考依据。　　 材料与方法：　　 1、pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG重组质粒载体构建用PCR扩增Aβ3-10片段10次，克隆CpG序列插入上述片段，从而获得目的基因Aβ(3-10)10-CpG，再把Aβ(3-10)10-CpG基因克隆入pcDNA3.1质粒载体，构建重组pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG载体，双酶切鉴定构建质粒。　　 2、动物分组与免疫方法15只3月龄APPSWE/PS1鼠，由中国医科大学实验动物中心提供，随机分成3组：对照组(n=5)、Aβ1-42组(n=5)和Aβ3-10组(n=5)。Aβ3-10组在接种前一天用布比卡因处理，首次分别取Aβ1-42疫苗、Aβ3-10疫苗及PBS液100 ug/只，肌肉注射相应组鼠左侧股四头肌，2周后予加强接种1次，以后每4周加强接种1次，共进行9个月。　　 3、空间学习记忆能力检测最后1次接种后1周用Morris水迷宫检查鼠空间学习记忆能力，前4天定位航行测试的8个Block的训练，实验观察和记录鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间，即记录其逃避潜伏期和游泳速度。空间探索用于测量学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。记录目标象限的游泳距离占总游泳距离的百分比，判断其学习和记忆的能力。排除游泳速度所致的差距。　　 4、鼠处死取标本每次免疫后2周取血，分装-70℃冻存。在10g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉下，从左心室快速灌注生理盐水100ml，迅速分离脑、脾脏、肝脏、肺脏和两侧肾脏，称其湿重量，脑组织匀浆，脾细胞增殖培养，余标本40g/L多聚甲醛固定。用ELISA检测抗体水平及IFN-γ、IL-10，酶标仪测各孔值并计算分析。　　 5、Western Blot检测重组质粒载体pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG构建及体外表达蛋白提取后，取等量样品进行聚丙烯凝胶电泳，经一抗、二抗孵育并显色，照像及分析。　　 6、免疫组织化学染色观察淀粉斑的沉积石蜡切片常规二甲苯脱蜡梯度酒精水化，分别加入一抗、二抗孵育染色，显色染色切片镜下照像并分析。　　 7、HE染色观察重要脏器的改变石腊包埋切片，常规HE染色，肾组织块六胺银染色(MSSG)观察基底膜。光镜下观察并照像。　　 8、统计学分析所有原始数据采用SPSS11.0分析软件进行处理分析，所有结果均表示为均数±标准差，样本均数比较采用单因素方差分析方法，正态分布及方差齐时，两两比较用LSD检验；非正态分布采用秩和检验，P<0.05有显著性差异。　　 实验结果：　　 1、Morris水迷宫结果Aβ1-42组、Aβ3-10组APPSWE/PS1鼠逃避潜伏期较对照组时间少，有显著性差异(P<0.05)，表明经训练后寻找平台的时间均缩短。空间探索试验显示Aβ1-42组和Aβ3-10组游泳轨迹主要是以中央型为主，围绕平台周围的轨迹较多，而对照组则主要是边缘型为主；在目标象限游泳距离百分比较对照组显著增高，并不受游泳速度影响。　　 2、Western Blot检测重组质粒载体pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG构建及体外表达成功构建重组质粒载体pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG，并在COS-7细胞中表达。　　 3、免疫组织化学染色和分析Aβ3-10组脑切片均未见成形的SP，偶见着色成棕色的颗粒，可能为沉积的淀粉样肽颗粒。Aβ1-42组可见少量的SP，而对照组可见大量的SP。　　 4、ELISA法检测抗体滴度、抗体亚型和细胞因子分泌Aβ1-42组和Aβ3-10组疫苗接种后诱导出高滴度的特异性抗Aβ42抗体，并随着接种次数的增多，血清抗体滴度逐渐增高。Aβ3-10组疫苗接种产生的抗Aβ42的IgG亚型以IgG2为主，且IgG2/IgG1<1提示Th2细胞的应答。Aβ3-10组IL-10升高而IFN-γ不升高，但是Aβ1-42组IL-10和IFN-γ均升高。　　 5、HE染色结果和分析三组鼠的重要脏器HE染色形态结构无异常，用六胺银染色观察各组鼠肾脏基底膜，未见基底膜破坏或抗原抗体复合物沉积。　　 结论：　　 1、成功构建pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG重组质粒载体，并能在真核细胞中表达。可将其作为阿尔茨海默病的候选疫苗。　　 2、表达Aβ3-10的CpG质粒载体可以减少3月龄AD转基因鼠APP/PS1的Aβ沉积，同时改善学习记忆功能，是预防AD的理想疫苗。　　 3、Aβ3-10疫苗在免疫接种后降低了Th1型免疫反应，提高Th2型免疫反应，减少脑内的炎性损害，是一种安全的、有效的治疗AD疫苗。