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猪圆环病毒(Porcine Circovirus, PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属成员,是迄今发现最小的哺乳动物病毒之一。其基因组为单链环状DNA,大小约为1.76kb,含有两个主要的编码框。主要分为两种型：猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2). PCV1被认为没有致病性,而PCV2被证实是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的病原,同时也可引起猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤、增生性坏死性肠炎。猪圆环病毒已在全球各地流行,给养猪业造成严重危害。目前,对于猪圆环病毒引起的相关疾病还没有有效治疗方法,只能采取疫苗接种进行预防,且效果不够理想。只有通过对该病毒的复制机理及蛋白功能进行更加深入的研究,才能找到更好的防治手段。Rep蛋白是一种多功能蛋白,在PCV2病毒复制的多个过程中都起着至关重要的作用。通过同源比对发现Rep蛋白的C端存在解旋酶功能域,而目前为止,对于Rep蛋白的解旋活性的研究还没有开展。本研究对PCV2的Rep蛋白解旋相关功能开展研究,为猪圆环病毒2型蛋白功能、复制及致病机理的研究提供参考。具体工作如下：1.Rep蛋白表达质粒的构建及蛋白的表达纯化扩增rep基因,将其连接到pET-28a SUMO、pET-30a等5种原核表达载体上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中对不同载体的表达纯化条件进行了摸索,最终选择pET-28a SUMO为表达载体,通过镍亲和层析纯化,得到了SUMO-Rep融合蛋白,并用SDS-PAGE及Western blot进行了鉴定。2.SUMO-Rep蛋白的ATPase活性检测利用Kinase-Glo Plus Luminescent Kinase Assay Kit对体系中剩余ATP的量进行检测,来测定ATPase活性。得到了酶促动力学相关参数,确定了Mg2+为ATPase反应最佳二价金属离子,证明了寡聚核苷酸的加入对ATPase活性无促进作用。3.SUMO-Rep蛋白的核酸结合活性检测用EMSA的方法证明了SUMO-Rep具有非特异性的ssDNA和带有3’突出端的dsDNA结合活性,且其结合不需要二价金属离子和ATP的参与。4.SUMO-Rep蛋白的解旋活性检测应用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)的原理,建立了SUMO-Rep解旋酶活性的检测方法,并对其解旋活性进行测定。得到酶促动力学相关参数,探究了二价金属离子、NTP、捕获链、温度对解旋反应的影响。确定了最佳反应金属离子及浓度为Mn2+15mM,最佳ATP浓度为2mM,最适温度为37℃,并在最适反应条件下测得SUMO-Rep的Km值为104.32nmol/L5.SUMO-Rep蛋白K180A突变体的构建与其ATPase口解旋活性检测构建了SUMO-Rep K180A蛋白突变体。活性检测发现其ATPase成功失活,且其解旋活性显著降低,说明K180A是Rep蛋白ATPase活性的关键位点。